Kamolzāles raibuma vīruss (CfMV- Cockfoot mottle virus) ir vienpavediena (+) RNS augu vīruss (Ghosh et al., 1979). Vīruss pieder pie Sobemovirus ģints, kam saimnieku loks ir viendīgļlapji (Sehgal et al,1993). Vīrusam ir ikosahedrāla simetrija, diametrs ~30nm, membrānas apvalka nav (Hull et al.,1995) Kapsīdas ir uzbūvētas no 180 viena tipa virsmas proteīna molekulām (~30 kDa). Struktūra atbilst T = 3 simetrijai. Genoma garums 4083 bp. RNS 5`galā ir VPg proteīns, bet 3` galā nav citiem vīrusiem raksturīgais poli (A) segments (Mäkinen et al., 1995b).

1.1. Vīrusa raksturojums

CfMV genoma organizācija sastāv no četriem ORF (skat. att.)(open reading frames-2. att.): ORF1 (P1 proteīns- genoma amplifikācijas faktors), ORF2a ( Serīna proteāze, VPg), ORF2b (RNS atkarīgā RNS polimerāze) un 3`- terminālais ORF3, kas kodē vīrusa vienīgo virsmas proteīnu (Tamm, Truve, 2000)

Virsmas proteīna (CP-coat protein) sekvence ir zināma pēc EMBL datubāzes (Acc. No. Z48630). CfMV CP salīdzinot ar radniecīgiem vīrusiem RYMV(Rice yellow mottle virus), 4SBV( Southern cowpea mosaic virus), 1SMV- (Sesbania mosaic virus) redzams, ka tā aminoskābju sekvence ir līdzīga par 30,5 % ar RYMV, par 19,3% ar 4SBV un par 19,3% ar 1SMV (Opalka et al., 2000.). Sekvenču līdzība dod iespēju prognozēt aminoskābju reģionus CfMV CP, kas varētu atrasties uz vīrusa virsmas (Zeltiņš, Pumpēns, nepublicēts). Šajos reģionos ar gēnu inženierijas metožu palīdzību var ievadīt svešu aminoskābju sekvences ar mērķi iegūt himēras vīrusus.

Stratēģijai, kad uz vīrusu virsmas tiek ekspresēti sveši polipeptīdi, ir vairākas priekšrocības: pirmkārt, šāds paņēmiens var palīdzēt interesējošā polipeptīda attīrīšanā, otrkārt, uz vīrusa daļiņas virsmas novietoti polipeptīdi izraisa daudzkārt efektīvāku imūnatbildi nekā sintētisko oligopeptīdu vakcīnas (Johnson et al.,1997). Augu vīrusus vai tiem līdzīgas daļiņas (VLP) ar svešiem epitopiem uz virsmas var iegūt, ekspresējot tos kā augu tā mikroorganismu sistēmās.

1.2. Ekspresija augos

Kā piemērus CP ekspresiju augos varam apskatīt divus augu vīrusus, kas ir izmantoti kā svešu epitopu nesēji, tabakas mozaīkas vīruss - TMV(Tobaco Mosaic Virus) un pupiņu mozaīkas vīruss- CPMV(Cowpea Mosaic Virus) (Johnson et al., 1997). TMV ir vienpavediena (+)RNS vīruss, genoma izmērs ir 6.4 kb. Vīruss veidojas inficētos augos lielos daudzumos (60 mg/g), kas parāda šo vīrusu kā efektīvu ekspresijas sistēmu. Helikālas simetrijas vīrusu daļiņas ir 300 nm garas un satur 2130 virsmas proteīna molekulu kopijas. Uz TMV daļiņu virsmas ir ekspresēts pentapeptīds Leu-enkephalin(Enk) ar opiātam līdzīgu aktivitāti, ievadot tā sekvenci pirms CP “stop” kodona (Takamatsu et al., 1990). Protoplastos CP + Enk proteīnu hibrīdu uzkrāja kā specializētu proteīnu, kura raža no parastā CP tipa bija tikai 30%. Taču hibrīdais vīruss tabakas augos izplatās lokāli tikai inficētajā lapā nevis visā augā. Infekcijas izplatīšanās visā augā - sistēmiska infekcija tika iegūta, ievadot “amber (UAG) stop kodonu starp CP gēna beigām un svešo peptīdu (gripas vīrusa hemaglutinīna vai cilvēka imunodeficīta vīrusa - HIV1 epitopus) (Skuzeski et al., 1986). Rezultātā izveidojās mozaīkas veida vīrusa daļiņas, attiecība starp modificēto un nemodificēto virsmas proteīnu bija starp 1: 200 un 1: 20 (Sugiyama et al., 1995). Imūnprecipitācijas reakcijas ar atbilstošiem antipeptīdu serumiem liecināja, ka ievadītie peptīdi atrodas uz vīrusu daļiņu virsmas.

Pupiņu mozaīkas vīruss (Cowpae mosaic virus-CPMV) ir Comovirus ģints (+)RNS augu vīruss. Vīruss inficē pākšaugus ar augstu iznākumu - 1-2mg/g. Genoms sastāv no divām atdalītām RNS (RNS1- 6.0 kb, RNS2 – 3.5 kb). CPMV kapsīdas satur 60 kopijas L (lielo) un S (mazo) CP ar ikosahedrālu simetriju. Viena no S proteīna cilpām uz kapsīda virsmas ir parādīta ar augstu sekvenču mainīguma pakāpi (Lomonossoff et al., 1995). Tādējādi, dažādas aminoskābes sekvences var tikt ievadītas šajā βB-βC cilpβ, netraucējot normālas vīrusa funkcijas. Tāpēc šī cilpa tika izvēlēta kā insertēšanas saits.

Izmantojot CPMV kā ekspresijas vektoru dzīvotspējīgu, ģenētiski stabilu himēru vīrusu konstruēšanai, tiek ieteikts ņemt vērā sekojošo (Porta et al., 1994., Usha et al., 1993), pirmkārt, svešās sekvences jāievieto CPMV sekvencē kā inserts, neaizvietojot natīva CP aminoskābes. Otrkārt, lai izvairītos no homoloģiskām rekombinācijām, sekvenču dubultošana nebūtu pieļaujama. Treškārt, precīza insertēšanas vieta S proteīna βB-βC cilpβ ir svarīga himērā vīrusa replikācijā. Ceturtkārt, inserta izmēri nevar būt lielāki par 30 amino skābēm (Porta et al., 1994). Pēc šiem noteikumiem ir tikuši izveidoti vairāk nekā 50 dažādu CPMV himēru vīrusu (Xu et al., 1996). Uz CPMV CP virsmas tikuši ekspresēti, piemēram, cilvēka rinovīrusa(HRV-14) epitopi un HIV-I epitopi. Pēdējie novērojumi liecina, ka CPMV himēras ir stabilas pat pie pH 1.0. Tas norāda, ka himērie vīrusi varētu saglabāt to struktūru gremošanas traktā un to varētu izmantot kā “ēdamu” vakcīnu.

1.3. Ekspresija E.coli

Natīvu tabakas mozaīkas vīrusa (TMV) CP ekspresēja un izdalīja no E.coli, taču spirālveida pseidovīrusu daļiņas E.coli šūnās neveidojās (Hwang et al., 1994). Ja svešā vienpavediena RNS molekulā ar gēnu inženierijas metodēm ievada noteiktu TMV RNS sekvences daļu - OAS (origin-of-assembly sequence -75-432 nt ) un šādi sintezēto RNS inkubē ar CP, kas ir izolētu no vīrusa, tas nodrošina spirālveida pseidovīrusa daļiņu veidošanos in vitro. No E.coli izolētajam CP šādu īpašibu nebija. Tomēr, ja izveido ekspresijas sistēmu, kurā vienlaicīgiE.coli šūnās veidojas CP un sveša, TMV OAS saturoša RNS (~2kb), tad in vivo CP ekspresija dod augstu spirālveida pseidovīrusu daļiņu iznākumu ~ 7.4 ± 1.4mg/mg no kopējā baktēriju proteīnu daudzuma. Līdzīgi arī TMV genoma (6.4kb) pilna garuma cDNS klona ekspresija E.coli uzrādīja augstu, ar imunoloģiskiem testiem detektētu CP līmeni. Interesanti, ka no E.coli izolētās TMV daļiņas bija infekciozas arī tabakas augiem.

Yusibov et al. (1996) panāca lucernas mozaīkas vīrusa - AMV (alfaalfa mosaic virus) virsmas proteīna ekspresiju E.coli. AMV rekombinanto CP (rCP) klonēja un ekspresēja E.coli kopā 37 aminoskābju garu peptīdu ar 6His. 6His sekvence tika izmantota ekspresēto proteīnu attīrīšanā. Puse no ekspresētajiem rCP bija šķīstoši un puse bija nešķīstoši. rCP savācās T=1 tukšās ikozahedrālās daļiņās, līdzīgi kā tas ir novērots vīrusa infekcijas procesa laikā augu šūnās. Kristalizācijas eksperimenti parādīja, ka CP daļiņas formējās heksagonālos kristālos, kas ir izomorfi parastiem CP daļiņas kristāliem. In vitro eksperimentos tika parādīts, ka sfēriskas daļiņas veidojās, ja rCP kombinē ar AMV RNS4 (mazākā AMV RNS). Nūjiņveida daļiņas veidojās, ja rCP kombinē ar RNS1 (lielākā genomiskā RNS).

1.4. Ekspresija raugos S. cerevisiae

Krol un līdzautori (1999) ekspresēja raugos brommozaīkas vīrusa (BMV) CP. Bromovīrusu genoms ir sadalīts trijos mRNS. RNS1 un RNS2 kodē RNS replikācijas faktorus. RNS3 kodē vīrusa “pārvietošanās” proteīnu (movement protein) un CP. CP tiek translēts no subgenomiskā RNS4. Autori ir parādījuši, ka S. cerevisiae šūnās CP gēna produkta in vivo var savākties divās dažāda veida kapsīdās- 180 un 120 subvienību kapsīdās. Kapsīdu savākšanos nodrošina savstarpēja CP mijiedarbība: 180-subvienību kapsīdas veidojas tipisko CP mijiedarbību rezultātā, bet netipiskās 120- subvienību kapsīdas veidojas, ja notiek tipisku un netipisku CP savstarpēja mijiedarbība. Lai noteiktu, vai BMV RNS iekapsidēšanās ir saistīta ar virālās RNS replikāciju, raugos ekspresēja BMV CP un BMV RNS2 zem rauga GAL1 promotera kontroles. CP ar RNS2 veidoja 88S vīrusam līdzīgas daļiņas, bet CP bez RNS2 veidoja 65S vīrusam līdzīgas daļiņas. Svešu epitopu ekpresijas iespējas šajā BMV/ S. cerevisiae sistēmā nav aprakstītas, bet, liekas, būtu iespējams panākt arī vakcīnu izveidošanu no augu vīrusa BMV un iegūšanu no raugu šūnām.

Augu vīrusu CP ekspresija raugos nav plaši pētīta un aprakstīta, tādēļ apskatīsim piemēru no dzīvnieku vīrusu CP ekspresijas raugos.

Sasnauskas un līdzautori (1999) ir ieguvuši poliomas vīrusa vīrusam līdzīgo daļiņu (VLPs) ekspresiju raugos augstā līmenī, izmantojot poliomas vīrusa CP (Forstova et al., 1995) par nesēju svešām aminoskābēm. Raugu šūnas tika izvēlētas par VLPs sintēzes saimnieku, jo tie ir labi izpētīti, droši un nekaitīgi mikroorganismi cilvēkam.

Vispirms, poliomas vīrusa CP gēnu sintezēja ar PCR palīdzību un klonēja E. coli (Salunke at al., 1986) plazmīdā pFR36 (Hassen Siray et al., 1998). Tad sekvences subklonēja rauga ekspresijas plazmīdā pFX7 (Sasnauskas et al., 1992) zem GAL10-PYK1 hibrīda promotora kontroles. Plazmīdu pFX7-CP transformēja rauga S. cerevisiae celmā AH22. Rauga ekspresētie HaPV CP proteīni spontāni savācās VLPs-vīrusiem līdzīgās daļiņās (Sasnauskas et al., 1999) Izdalītos proteīnus denaturētos apstākļos analizēja Vesterna blotā, lietojot truša antivielas. Iznākums bija ~ 0.1 - 0.2 g vīrusiem līdzīgu daļiņu uz litru rauga kultūras (40g mitrās rauga masas). Šī vīrusa VLP tiek uzskatītas kā iespējamās svešas nukleīnskābes nesējas gēnu terapijas mērķiem (Forstova et al., 1995).

Svarīgi arī ir atzīmēt, ka pirmo rekombinanto vakcīnu pret hepatītu B ieguva no S. cerevisiae, sintezējot HBsAg vīrusiem līdzīgās daļiņas rauga šūnās (Ada and Ramsky, 1997).

Tātad, minētie piemēri liecina, ka ir iespējams ekspresēt raugos S.cerevisiae dažādu vīrusu virsmas proteīnu gēnus. Raugu šūnās veidojas arī vīrusiem līdzīgas daļiņas, kas var kalpot kā svešu vīrusu epitopu nesējas- vakcīnu kandidāti.

Atpakaļ