3. Rezultāti un to analīze

Pirmie mēģinājumi iegūt vīrusiem līdzīgas daļiņas (VLP) no CfMV virsmas proteīna jau ir veikti, ekspresējot CP gēnu E.coli. Diemžēl visās pārbaudītajās vektoru sistēmās un pie dažādiem kultivēšanas apstākļiem virsmas proteīns uzkrājās šūnās ieslēguma daļiņu (inclusion bodies) formā (A. Zeltiņš, pers. commun.) un VLP E.coli šūnās netika atrastas. Tāpēc bija interesanti pārbaudīt šī gēna ekspresijas iespējas cita saimnieka – S.cerevisiaešūnās.


3.1. Plazmīdu konstruēšana.

No vīrusa cDNS klona, kas tika saņemts no Prof. E.Truves (Tallina) ar PCR palīdzību tika iegūta virsmas proteīna gēna kopija ar piemērotiem saitiem (NcoI un HindIII) 5’un 3’ galos klonēšanai ekspresijas vektorā pTrc99A . 3’galā vienlaicīgi ar restrikcijas saitu praimers saturēja arī kodonus 6 histidinu ievadīšanai, kas var atvieglot CP attīrīšanu uz Ni-Sepharose kolonas. Tika iegūtas pilnā garuma CP6H un

N-termināli līdz 3 Met saīsinātas CfMV CP kopijas (plazmīdas pTCP6H un pTCP3M6H,(skat. att.)). Sekvenču atbilstība vīrusa CP tika pārbaudīta sekvenējot. Ekspresijas vektori CfMV CP un tā atvasinājumu ekspresijai E.coli bija konstruēti jau pirms šī darba uzsākšanas.

Šīs plazmīdas manā darbā tika izmantotas kā izejas konstrukcijas E.coli/S.cerevisiae “shuttle”-“atspoles” vektoru izveidošanai. No Prof. K. Sasnauskas (Viļņa, Lietuva) tika saņemts E.coli/S.cerevisiae “shuttle” vektors pFGG (skat. att.), kas ir publicētā vektora pFX7 atvasinājums (Sasnauskas et al., 1992). Vektors satur pIC19H daļu, kas nodrošina plazmīdas replikāciju E.coli un ampicilīna rezistenci, 2μmS.cerevisaereplikonu un formaldehīda rezistences gēnu FDH, kas kalpo kā selekcijas marķieris rauga šūnām ar plazmīdu. Nepieciešamo gēnu klonē zem GAL10-PYK1 hibrīda promotera kontroles. Vislabākais klonēšanas saits ekspresijai ir XbaI.

“Shuttle” vektoru konstruēšana attēlota. Lai izmantotu jau klonētos un sekvenētos CP gēnu atvasinājumus, bija nepieciešams ievadīt XbaI saitu pTCP6H vektorā īsi pirms CP gēna starta kodona. Lai to panāktu: 1) ar PCR palīdzību tika amplificēta pTCP6H vektora daļu starp EheI un NcoI saitiem, vienlaicīgi ievadot XbaI saitu pirms NcoI saita

2) PCR produkts pēc NcoI/EheI restrikcijas tika klonēts atpakaļ pTCP6H vektorā. Tā kā CP6H gēns satur divus NcoI saitus, pēc EheI sašķelšanas bija nepieciešams veikt daļēju NcoI restrikciju. Pēc sadalīšanas agarozes gēlā tika izolēts garākais NcoI/EheI fragments.

Tālāk iegūtā plazmīda pTCP6H-X tika klonēta pUC19 vektorā XbaI un SalI saitos. Lai iegūtu CfMV CP gēnu, kam abos galos būtu XbaI saits, iegūtās plazmīdas pUC-CP6Hx SmaI/SalI fragmentu klonē vēlreiz pUC19 vektorā, attiecīgi ar Klenow fermentu “aizpildītā” HindIII saitā un SalI saitā. Iegūtā plazmīda satur XbaI saitus abpus CP6H gēna. Šo konstrukciju izmanto arī saīsinātā CP gēna ievadīšanai starp XbaI saitiem.

Abus CP gēna variantus no konstrukcijām pUC-CP6Hxx un pUC-CP3M6Hxx pēc restrikcijas ar XbaI ligē ar pFGG. Pēc ligācijas DNS transformē DH5α šūnās.

No abiem ligācijas maisījumiem pēc transformācijas un izsēšanas uz ampicilīna platēm tika iegūtas kolonijas, kuru lizāti pēc plazmīdu miniprepa veikšanas tika pārbaudīti, vai tās satur plazmīdas. Kā redzams no, vairums plazmīdu ir liela izmēra, bet novērojami arī īsāki varianti. Tas var liecināt par“shuttle” vektora zināmu nestabilitāti E.coli šūnās. Dažas visgarākā izmēra plazmīdas tika sagrieztas ar HindIII restriktāzi. lai pārliecinātos par CP gēna esamību konstrukcijās. Plazmīdā bija seši HindIIIsaiti, attiecīgo fragmentu garumi klonam 606 bija 2574bp, 538bp, 1930bp, 231bp, 262bp un 3909bp, klonam 303 2374bp, 538bp, 1930bp, 231bp, 262bp un 3909bp,, Interesējošais fragmenta garums klonam 606 bija 2574bp, bet klonam 303 bija 2374bp. Pēc restrikcijas analīzes izrādījās, ka kloni 303 un 606 satur attiecīgi CP3M6H un CP6H gēnus pareizajā orientācijā. Abu klonu plazmīdu DNS pēc attīrīšanas tika izmantoti rauga S.cerevisiae FH4C transformācijā.

3.2. CfMV virsmas proteīna atvasinājumu ekspresija S.cerevisiae

S.cerevisiae FH4 šūnas tika izaudzētas no vienas kolonijas YEP barotnē ar 2% glikozes 12h uz kratītāja pie 30˚C līdz agrai eksponenciālai augšanas fāzei (OD600 5.0) un sagatavotas elektoporācijai. Tā kā rauga šūnu transformācija norit ar visai zemu efektivitāti, nepieciešams relatīvi daudz plazmīdas DNS. Pēc transformācijas ar vektoru pFG-CP6H tika iegūtas kopsummā 22 kolonijas, ar pFG-CP3M6H (skat. att.) – tikai 9 kolonijas. Tas liecina par ārkārtīgi zemu transformācijas efektivitāti (mazāk kā 10 formadehīda rezistentas S.cerevisiae kolonijas uz 1 μg plazmξdas DNS). Šī darba vajadzībām efektivitāte būtu pietiekoša, bet citiem mērķiem vajadzētu elektroporācijas procesu optimizēt, pārbaudot tādu faktoru ietekmi, kā rauga kultivēšanas apstākļus un augšanas fāzi pirms šūnu sagatavošanas.

Kolonijas tika pārsētas 1 ml YEP barotnes ar 2% glikozes un kultivētas 24h 30 ˚C termostatā bez kratīšanas. No pFG-CP6H variantiem pēc pārsēšanas šķidrajā barotnē izauga 4 kloni, no pFG-CP3M6H – tikai viena. No visiem šiem raugu kloniem tika izolēta plazmīdas DNS un retransformētas E.coli DH5α πūnas. Visi pārbaudītie plazmīdu “miniprepi” saturēja attiecīgos “shuttle” vektorus, kuru restrikcijas aina ar HindIII neatšķīrās no transformācijai ņemto vektoru ainas.

Attiecīgie S.cerevisiae 4 pFG-CP6H kloni un 1 pFG-CP3M6H (skat.zîm) klons tika iesēti YEP barotnē ar 2% glikozes un audzēti 12h uz kratītāja pie +30˚C. Pēc induktora – galaktozes (līdz 3%) pievienošanas kloni tika kultivēti vēl 24h. Raugiem S.cerevisiae ir raksturīgs augsts biomasas iznākums – šūnu daudzums sasniedza vairāk kā 20 optiskās vienības (OD600).

Pārbaudot pilnā garuma CP6H ekspresiju pēc 24h kultivēšanas ar induktoru– galaktozi, izrādījās, ka attiecīgo klonu ekstrakti neviens nesaturēja pareiza garuma (teorētiskā molekulmasa 28400 Da) proteīnus, kas reaģētu Western blotā ar poliklonālajām antivielām, kas iegūtas pret natīvu CfMV. Vājas zonas imunoblotā tika konstatētas reģionā, kas atbilst zemākas molekulmasas proteīniem. Tas varētu liecināt, ka nelieli daudzumi sintezētā CP6H varētu būt šūnu augšanas laikā degradējušies. Nav izslēgta arī nespecifisku signālu parādīšanās uz blota, jo arī ar izejas pFGG plazmīdu transformētie kloni deva līdzīgu ainu.

Saīsinātā CP3M6H klona ekspresija līdzīgos apstākļos deva vāju, bet specifisku, pēc proteīna garuma (21150 Da) atbilstošu signālu imunoblotā. Šī klona CP3M6H ekspresija tika imunoblotā analizēta sīkāk. Noskaidrojās, ka

proteīna sintēzei tiešām ir nepieciešamas vismaz 24h, jo 8h paraugā proteīna signāls vēl ir ļoti vājš, praktiski viss sintezētais CP3M6H atrodams nešķīstošo proteīnu frakcijā, t.i., frakcijā, kuri nebija ekstraģējami ar R buferi, kas satur Tris, NaCl, PMSF un TX-100.

Šie rezultāti varētu liecināt, ka CP3M6H proteīns izveidojis relatīvi viegli šķīstošus agregātus ar šūnu membrānām, kuri centrifugēšanas laikā nogulsnējušies kopā ar nešķīstošajiem proteīniem. Lai to pārbaudītu, rauga biomasas proteīnu frakciju, kas nešķīda buferī R, pakāpeniski ekstraģējām ar buferšķīdumiem, kas saturēja 20 mM Tris (pH 7.5) un pieaugošas urīnvielas koncentrācijas. Redzams, ka imunoblotā pirmie signāli parādās tikai pēc ekstrakcijas sākot ar 6M urīnvielu. Tāpēc jāsecina, ka CP3M6H proteīns arī rauga šūnās, līdzīgi kā E.coli, veido denaturētus agregātus, kuri šķīst tikai buferšķīdumos ar augstu haotropo vielu (urīnviela, guanīdija hlorīds) koncentrāciju. Šie rezultāti liecina, ka ekspresijas sistēma izmantojot pFGG vektoru un raugu S.cerevisiae FH4C nav piemērota vīrusiem līdzīgu daļiņu iegūšanai no CfMV vīrusa CP, jo: zems iegūtā proteīna daudzums, proteīns veido denaturētus agregātus rauga šūnās.

Lai šos sistēmas trūkumus pārvarētu, būtu nepieciešams pārbaudīt citus S.cerevisiae celmus un veikt eksperimentus ar kultivēšanas apstākļiem (piem., barotnes sastāvs, un aerācija).

Atpakaļ