Centrifūgas.

• Biofuge B, Heraus sepatech (Vācija)
• Centrifuge MPW-331, Meshanika precyzyjna(Polija)
• Centrifuge S415D, Eppendorf AG, (Vācija)
• MLW, Janetzkie K-23, (Vācija)
• Microspin FVL-2400, Biosan Sci, (Latvija)

Elektroforēzes kameras.

• GH-100, Gelhaus, BIOphile, (Koreja)

• 2050 MIDGET, LKB BROMMA, (Zviedrija)

Fotometrs

• CФ-26ХЛ42, (Krievija)

Gēla fotogrāfēšanas iekārta

• C-80 Epi Illumination UV Darkroom, UVP Cambrige, (Anglija)

UV-Iluminātors

• 2011 MACROVUE Transilluminator, LKB, (Zviedrija)

Kratītāji

• INFORS AG CH-4103 BOTTINGEN, (Vācija)
• MS-90E ,ЄНЄРГОТЄХНИКА, (Latvija)
• Titertek, Flow Laboratories (U.K.)

Laminārs

• 10 AC-1Б (Krievija)

Ledusskapis

• SANYO ULTRA LOW, (Japāna)
• Snaige-117, (Lietuva)

Maisītājs

• MM3M, МИНПРИБОР, (Krievija)

Pipetes

• Eppendorf,(Vācija)

Strāvas avots

• 2002 POWER SUPPLY, LKB BROMA, (Zviedrija)

Svari

• L610D , Sartorius laboratory, (Vācija)

Termo bloks

• THERMO BLOCK TDB-120, BIOSAN, (Latvija)

PCR termosaiklers

• Mastercycler, Eppendorf (Vācija

Termostats

• TCH 100, LABORATORNÍ PŘÌ
STROJE PRAHA,(Čehija)

LB šķidrā barotne 1l

SOC barotne E.coli transformācijai 100ml

2x TY šķidrā barotne 1l

YEP šķidrā barotne 1l

Rauga ekstrakts 10g

Blota buferis

Lemli buferis SDS PAGE paraugu sagatavošanai

PBS buferis 10x 1l

TE buferis

Savācošais SDS gēls 4%

Sadalošais SDS gēls 12%

Agara gēls 0.8% DNS sadalīšanai elektroforēzē 100ml

Baktērijas - Escherichia coli DH5α no laboratorijas kolekcijas

Raugi - Saccharomyces cerevisiae FH4C no Prof. Sasnauskas (Viļņa, Lietuva)

2.5. Mikroorganismu kultūru audzēšana

E.coli audzēšana šķidrā barotnē

• Šķidro barotni 2 x TY ielej 0.5l apaļkolbā vai 3 ml. stobriņā

• Pievieno ampicilīnu (100 mg/ml) un samaisa, ar sterilu cilpiņu apaļkolbā vai stobriņā ienes vienu koloniju.

• Liek uz kratītāja 140 apgr/min., + 37˚C, 16 stundas.

E.coli audzēšana uz plates

• 20ml agarizētā LB barotne, petri platē.
• Pievieno 20μl ampicilξ
nu (100 mg/ml),
• Kad barotne ir cieta pievieno 1 ml šūnas ar barotni un ar stikla spieķīt izlīdzina, barotni nožāvē.
• Audzē termostatā pie +37˚C.

E.coli kompetento šūnu sagatavošana

• 50 ml 2 x TY barotnei pievieno 0.25 ml MgSO₄ 2M un 0.25 ml 40% glikozes
• Audzē uz kratītāja līdz OD
₅₄₀ = 0.5
• Pa 200μl katrβ
ependorfa stobriņā, glabā pie -70˚C.

2.6. Plazmīdu izolēšana

2.6.1. Plazmīdas izolēšana no E.coli (Minipreps)

• 1.5 ml kultūras pārnes “ependorfa” stobriņā. Centrifugē 2min 13000 apgr/min.

• Supernatantu nolej, pievieno 300 μl lizηšanas P1 buferi:
• Rūpīgi resuspendē ar vorteksu.
• Pievieno 300μl lizη
šanas P2 buferi:
• Viegli samaisa nevorteksējot, atstāj 4 min. RT, pievieno 100μ
l CHCl₃
• Pievieno 300μl P3 buferi: 3M Kβ
lija acetātu, viegli samaisa nevorteksējot.
• Centrifugē 10 min. 10000 apgr/min.(9300rcf) RT.
• Supernatantu pārnes jaunā stobriņā, pievieno 700μl izopropanolu, viegli samaisa, centrifugē 10 min. 10000 apgr/min., + 4˚C.
• Supernatantu nolej, nogulsnes mazgā ar 700 μl 70% etanolu, centrifugē 10 min. 10000 apgr/min.
• Supernatantu nolej, nogulsnes žāvē 15 min.
• Nogulsnēm pievieno 50μ
l sterilu dH₂O.

• Ja nepieciešams ļoti tīrs preparāts:
• Miniprepu turpina, nogulsnēm pievienojot 50 μl dH₂O un 5μl 1MTris pH8.
• Pievieno 16 μl hloroforma un 16 μl fenola πķīdumu, samaisa vorteksējot, atstāj uz 5 min., atkal vorteksē pēc tam centrifugē 4min 13000 apgr/min.
• Supernetantu pārnes jaunā stobriņā, tam pievieno 1/10 tilpuma vienības P3 buferi.( 3M Kālija acetāts), samaisa vorteksējot.
• Pievieno 0.8 tilpuma vienības izopropanolu, samaisa un centrifugē 5min. 13000 apgr/min.
• Supernatantu nolej, nogulsnes mazgā ar 50 ml 75% etanolu, samaisa un centrifugē 5min. 13000 apgr/min.
• Supernatantu nolej, nogulsnes žāvē 15 min.
• Nogulsnēm pievieno 20μl dH₂O.

2.6.2. Plazmīdas izolēšana no S.cerevisiae (Minipreps)

• 100μl fenolu un 100μl hloroforma π
ķīdumu.
• Vorteksē 2min., pievieno 200μl TE buferi, samaisa vorteksējot.
• Nocentrifugē 5min., 13000apgr./min RT.
• Augšējo fāzi pārnes uz jaunu ependorfa stobriņu
• Pievieno 2 tilpuma vienības 100% etanola šķīduma RT, centrifugē 2min., 13000apgr/min.
• Supernatantu ar pipeti uzmanīgi noņem
• Pievieno 500μl 70 % etanolu, samaisa, nocentrifugη
3sec.
• Supernatantu noņem, nogulsnes žāvē.

PCR reakcijas maisījums (100 μl) ( Pēc MBI Fermentas protokola #EP0401)

2.7. Restrikcija

• Inkubē 3h +37˚C

• Inkubē 16 h pie +16˚C. Pēc reakcijas beigām ligāzi denaturē pie 65˚C 15 min.

2.9. E.coli šūnu transformācija

2.10. DNS fragmenta ekstraģēšana no gēla.

(Pēc ekstrakcijas kita #K0513 protokola, MBI Fermentas (Lietuva)).

• DNS fragmentu ar skalpeli uz UV-iluminātora izgriež no gēla.
• Fragmentu ievieto “ependorfa” stobriņā un nosver.
• Pievieno 0.5 tilpuma vienības TBE konversijas buferi un 4.5 tilpuma vienības NaJ šķīdumu, karsē 5 min. 55˚ t
• Pievieno 5μl labi samaisξ
tu stikla pulvera suspensiju, karsē 5 min. 55˚ t
• Centrifugē 30 sec., supernatantu noņem ar pipeti.
• Nogulsnes mazgā trīs reizes ar 400μl aukstu mazgāšanas buferi. Pirms katras mazgāšanas kārtīgi suspendē, centrifugē 5 sec. Pēc trešās reizes šķidrumu uzmanīgi noņem ar pipeti.
• Nogulsnes žāvē 15 min.
• Pievieno 20μl dH
₂O, samaisa un nocentrifugē.
• Supernatantu pārnes jaunā stobriņā un analizē uz agarozes gēla.

2.11. Rauga elektroporācija

(Adaptēts pēc: Grey M., et al., 1992, http://www.upstate.edu)

• Raugu šūnas audzē YEPD barotnē +30˚C līdz OD(600nm) = ~ 5.0 (apm.16h)
• Šūnas centrifugē 5min. 3000 apgr/min. +4˚C, šūnas tur uz ledus.
• Supernatantu nolej, šūnas mazgā ar 40 ml ledus aukstu dH
₂O, centrifugē 5min. 2500 apgr/min +4˚C
• Supernatantu nolej, šūnas mazgā ar 20 ml ledus aukstu dH
₂O, centrifugē 5min. 2500 apgr/min. +4˚C
• Supernatantu nolej, pievieno 5 ml aukstu 1M sorbitola šķīdumu, suspendē to, centrifugē 5min., 2000 apgr/min, +4˚C.
• Supernatantu nolej, pievieno 200 μ
l aukstu 1M sorbitola šķīdumu, suspendē to, patur +4˚C.
• Elektroporācijas kivetē 100μl šūnu sajauc ar 7μ
l (1μg/μl) DNS.
• Elektroporācijas aparātam BioRad ieregulē spriegumu V=1,5 kV; pretestību 200Ώ, kapacitāti 25μF. Šādos apstākļos elektroporācija notiek
4-5 sec.
• Pievieno 1ml auksta 1M sorbitola, samaisa un pārnes jaunā ependorfa stobriņā, tur uz ledus.
• Šūnas uzsēj uz agarizētas YEP barotnes ar 2% glikozi un ar dažādām FA-formaldehīda koncentrācijām (10mM, 12mM, 15mM) audzē 2 –3 dienas +30˚C termostatā

2.12. Raugu proteīnu izolēšana

• Sasaldē rauga šūnas -20˚C
• Atkausē rauga šūnas uz ledus, pievieno 200mg stikla lodītes, 250μ
l R buferi:
• Samaisa vorteksējot un pastāvīgi turot šūnas uz ledus.
• Centrifugē 15 min., 10000apgr./min., +4˚C; supernatantu pārnes jaunā stobriņā pievieno 200μ
l Lemli buferi
• Nogulsnēm pievieno 200μl Lemli buferi, samaisa vorteksējot 1min
• Centrifugē 5min., 10000apgr./min., +4˚C ,
• Supernatantu pārnes jaunā stobriņā

2.13. Imunoblots

2.13.1. proteīnu pārnese uz membrānas

• Uz gēla denaturējošos apstāķļos sadala proteīnus pēc to garuma
• Sagatavo 6 Watman papīrus gēla izmēros
• Gēlu un membrānu iemērc blota buferī 5-10 min.
• Vatman papīrus iemērc blota buferī; uz pozitīvās plates saliek 3 papīrus vienu uz otra, bez gaisa burbuļiem.
• Tad liek membrānu, uz membrānas gēlu, uz gēla 3 Watman papīrus.
• Blota aparātu pieslēdz pie strāvas avota ar 1mA/cm
² strāvas stiprumu, 60`min.

2.13.2. Blota apstrāde ar antivielām

• Inkubē, viegli maisot, 30 min šķīdumā:

• Mazgā ar 1x PBS buferi 5min
• Inkubē, viegli maisot ar specifiskajām antivielām (anti-CfMV, 1:1000) PBS buferī 16 h, +4˚C
• 3x mazgā ar PBS 5-20 min (RT - istabas t
^o ) .

• Inkubē, viegli maisot ar sekundārajām antivielām (pret trušu lgG) 1:2500 1xPBS, 4h RT.
• 2x mazgāt ar PBS buferi 5-10 min.

• Poliakrilamīda gēlu ievieto plastmasa trauciņā, kurā ir fiksēšanasa šķīdums:

Trauciņu liek uz kratītāja 30 min.

• Fiksē 60 min. šķīdumā:

• Fiksē 10% glutaraldehīdā 30 min.
• Gēlu mazgā 4 reizes ar ūdeni, katru reizi 30 min.
• Krāso gēlu ar sudraba nitrāta šķīdumu:

30% NH₄OH 3.5 ml

0.36% NaOH 42ml

19.4% AgNO₃ 8ml

H₂O → 200ml

• Inkubē 15 min. intensīvi maisot.

• Pārnes gēlu jaunā plastmasas trauciņā un mazgā 5 reizes ar ūdeni (precīzi1 min. katrai mazgāšanai)

• Gēlu pārnes jaunā plastmasas trauciņā, pievieno attīstītāju:

50mg Na citrāts

50 μl 37% formaldehξda šķīdums

H₂O → 100ml

• Intensīvi maisa līdz zonas ir labi saskatāmas.

• Fiksē šķīdumā: 10% etanolā, 10 % etiķskābē.

2.13.4. Blota attīstīšana

• 10-30`min (vai vairāk) inkubē viegli maisot (tumsā!) sekojošā šķīdumā: