Saturs
1. Kamolzāles raibuma vīrusa raksturojums
2. Puķkāposta mozaīkvīrusa (CaMV Cauliflower mosaic virus) promoters 35S
3. 35S promotora pielietojums infekciozo vīrusu cDNS konstrukcijās
1. Kamolzāles raibuma vīrusa raksturojums
Kamolzāles raibuma vīruss (CfMV Cockfoot mottle virus) ir vienpavediena (+) RNS augu vīruss (Ghosh et al, 1979). Tas pieder pie Sobemovirus ģints, dabiskos apstākļos inficē tikai kamolzāli (Dactylis glomerata), laboratorijā iespējams inficēt arī dažu graudaugu Granineae sugas auzas, rudzus, miežus, kviešus (Serjeant, 1963). Vīrusu dabā pārnēsā vismaz divas Chrysomelidvaboļu sugas: Lema melanopa un L. lichenis (Serjeant, 1967; Chatherall, 1968), un nav novērots, ka tās savā uzturā izmantotu komerciālās graudzāles (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Vīrusam ir ikosahedriska simetrija, tā diametrs ir ~30 nm, membrānas apvalka nav (Hull et al, 1995). Kapsīds ir uzbūvēts no 180 viena tipa virsmas proteīna molekulām (~30kDa). Struktūra atbilst T=3 simetrijai (skat. 1. att.). Genoma garums 4083 bp. RNS 5 galā ir VPg proteīns, bet 3 galā nav citiem vīrusiem raksturīgais poli (A) segments (Mäkinen et al, 1995).
A B
1.attēls. CfMV viriona T-3 ikozahedrālā struktūra (A EM, B shematisks attēlojums)
Figure 1. CfMV virion T-3 ikosahedral structure (A EM, B model drawing)
CfMV genoms sastāv no četriem ORF (open reading frames): ORF1 - P1 proteīns genoma amplifikācijas faktors VPg, ORF2a - Serīna proteāze, ORF2b RNS atkarīgā RNS polimerāze, un 3 terminālais ORF3, kas kodē vīrusa vienīgo virsmas proteīnu (Tamm, Truve, 2000) (skat. 2. att.). Visu Sobemovīrusu grupas vīrusu genoma organizācija ir līdzīga un diezgan vienkārša, kas dod iespēju uz šo vīrusu bāzes veidot vektorus.
2. attēls. ORF novietojums CfMV genomā
Figure 2. ORF lacalisation in CfMV genome
2. Puķkāposta mozaīkvīrusa (CaMV Cauliflower mosaic virus) promoters 35S
CaMV ir sfērisks, DNS saturošs augu vīruss, kas pieder pie pararetrovīrusu grupas (Powell et. al., 1999) (skat. 3. att.). CaMV var inficēt daudzus krustziežu dzimtas augus (Schoelz & Bourque, 1999). Vīruss inficē lielāko daļu auga šūnu un producē ~ 105 daļiņas uz šūnu, katra daļiņa satur vienu molekulu no virālā genoma 8 kbp cirkulāru, divpavediena DNS un ar vienu kopiju no katra 35S un 19S - promotora (Hull et. al, 2000).
3. attēls. CaMV ārējā uzbūve (Powell, 1999)
Figure 3. Outer look of CaMV (Powell, 1999)
Apmēram pirms 15 gadiem CaMV bija viens no dažām ģenētiskajām sistēmām, kurš tika pētīts ar mērķi izmantot to augu transformācijai (Hull, 1983; 1984; 1985). CaMV genoms bija pirmais nozīmīgākais augu vīrusu DNS fragments, kurš ir pilnībā nosekvenēts (Frank et al, 1980) . Abi CaMV promotori 35S (~ 400bp garš) un 19S bija pirmie augu vīrusu identificētie promoteri (Covey et. al, 1981; Hull & Covey, 1983; Odell et. al, 1995).
CaMV 35S promoters ir bieži ticis izmantots transgēno augu konstrukcijās apmēram 80 % no ģenētiski modificētajiem augiem heterologie gēni klonēti aiz 35S promotora (GM) (Hull., Covey & Dale et. al, 2000).
35S promotora priekšrocības ir tādas, ka tas ir daudz aktīvāks par citiem un to stipri neietekmē apkārtējie vides apstākļi vai kultūru veids (Cummins et. al, 1994). Tā darbības aktivitāte palielinās pat trīs reizes, ja izveido kompleksu ar diviem 35 S promotoriem (Bu-Jun Shi, Shou-Wei Dingt & Symons, 1997), un palielina pat līdz 10 reizēm svešu gēnu darbību transgēnajos augos (Kay et al, 1987).
Taču šim promoteram ir arī savas nepilnības. Tam ir tieksme uz rekombinācijām (Kohli et. al, 1999); tam ir daži domēni ar dažādu audu specifiskumu; tas ir ļoti iedarbīgs un var funkcionēt ļoti daudzos organismos, ne tikai augos, bet arī baktērijās un dzīvniekos (Hull et. al, 2000).
3. 35S promotora pielietojums infekciozo vīrusu cDNS konstrukcijās
Ir daudzi piemēri šī promotora lietošanai gan viendīgļlapjos, gan divdīgļlapjos (Ho, Ryan & Cummins, 1999). Apskatītajos piemēros ir dažādi attālumi starp 35S promotoru un cDNS.
pJIT-60 TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGGACA GCCC AAGCTTGGG
(http://www.pgreen.ac.uk/)
pCass2T TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGGACA GGCC TGGGTACCGAG
(Bu-Jun Shi, Shou-Wie Dingt & Symons, 1997)
pHST40 TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGGACA AGGCCTGCAGTCGACT
CTAGAGGATCCCGGG
(Scholthof, 1999)
P34-2X35S
GAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCAC
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAG
GAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACAGCCCAAGCTAACGATAATAGTGCGAAGAAAGACACACTGTTATCGTTCCCCTCCCGAATCAGA
(šajā darbā konstruēts)
4. attēls. Konstrukcijas ar 35S promotoru. Iekrāsotā daļa ir 35S promotora 3gala sekvence, kas ir kopīga visām konstrukcijām. Izceltie rajoni restrikcijas saiti, pa kuriem tiek veikta klonēšna. Konstrukcijā pJIT-60 vīrusa cDNS var tikt klonēts pēc 10 nukleotīdiem, konstrukcijai pCass2T pēc 8 nukleotīdiem, bet konstrukcijai pHST40 pēc 23 nukleotīdiem. Mūsu veidotajā konstrukcijā cDNs tika klonēts pēc 10 nk.
Figure 4. cDNA constructions with 35S promoter. Marked area is 35S-promoter 3-end sequence, which is common in all constructions. Display area cloning sites. In vector pJIT-60 virus cDNA can be cloned with a 10 nucleotides space, pCass2T - 8 nucleotides space, but pHST40 - after 23 nucleotides. In our construction cDNA was inserted after 10 nk.
Zinātnieku grupa (Mais et. al., 1992) izveidoja konstrukciju, kura saturēja pilna garuma PPV (plum pox potyvirus) cDNS un CaMV 35S promotera DNS. Konstruēšanai tika ņemts šī vīrusa pilna garuma cDNS klons, kas tika izolēts no PPV. cDNS tika konstruēta tā, lai PPV cDNS 5 gals ir tieši klāt pie 35S promotora transkripcijas iniciācijas saita. Augus inficēja plazmīdu ieberzējot augu lapās. Inficējot Nicotiana benthaminana, tika novērota sistēmiska infekcija. Inficēto augu pārbaude uzrādīja PPV specifiskas vīrusa daļiņas, kā arī vīrusa RNS, virsmas proteīnu un arī nestrukturālus lielus kodola proteīnu ieslēgumus.
Vaita institūta zinātnieku grupa (Bu-Jun Shi, Shou-Wie Dingt & Symons, 1997) veica eksperimentu ar dubultu 35S promotoru uz TAV (tomato aspermy cucumovirus), kas tika klonēti uzlabotā pCass vektorā pCass2. Pilna garuma cDNS no trim genomiskajiem TAV RNS tika ieklonēti pCass2 (pCass2T), deva 3 reizes augstāku infekciozitāti augos nekā klons ar vienu 35S promotoru. Plazmīdas tika inokulētas augos, kuri tumsā bija atradušies 24h. Pēc inficēšanas tika novēroti vīrusam raksturīgie simptomi, kā arī vīrusam līdzīgu daļiņu veidošanās un novērota vīrusa RNS veidošanās.
Teksasas A&M universitātes zinātnieks veica eksperimentu ar TBSV (tomato bushy stunt virus) cDNS (pHST40), novietotu starp modificētu 35S promotoru, delta hepatīta antigenomisko ribozīmu un nopalīna sintēzes gēna poliadenilācijas signālu. Infekciju augos panāca ar vienkāršu plazmīdu ierīvēšanas paņēmienu augu lapās (Scholthof, 1999).
Divi Ķīnas zinātnieki veica eksperimentus ar PRSV HA (Hawaii strain of papaya ringspot potyvirus) vīrusu. Tika izveidota konstrukcija ar pilna garuma cDNS un 35S promotoru, un nopalīna sintēzes (NOS) trminatoru. Augi tika inficēti ar attīrītu plazmīdu, kas tika mehāniski ieberzēta, kā arī bombardētas ar daļiņu pārneses sistēmu. Infekciozitāti noteica ar ELISA metodi, seroloģiski specifisku elekktronmikroskopisku analīzi ar PRSV antiserumu (Chu-Hai Chiang & Shyi-Dong Yeh, 1996).