Kopsavilkums

Barotnes veids Shapes of culture medium	Triptons (g) (Merck, Vācija) Tripton (g), (Maerk, Germany)	Rauga ekstrakts (g) (Merck, Vācija) Yeast extract (g), (Maerck, Germany)	NaCl (g)	Agars (g)	NaOH (ml)	KCl (g)	MgCl2 ·6H2O (g)	MgSO4 (g)	Glikoze (g) Glucose (g)
LB agarizētā barotne (g/l)	10	5	10	15
LB šķidrā barotne (g/l)	10	5	5		1
SOC barotne *E. coli* transformācijai (100 ml)	2	0,5	0,58			0,19	0,203	0,12	0,36
2x TY šķidrā barotne (g/l)	16	10	5

3. Reaktīvi un fermenti

TBE buferis:

Tris base 18 g

Borskābe 55 g

EDTA 7,6 g

pH 7,1

0,8 % agara gēls DNS sadalīšanai elektroforēzē (40 ml):

TBE buferis (1x) 40ml

Agars (FERK, Vācija) 0,32 g

Etīdija bromīds (MERCK,Vācija) 5ml

2. tabula

Restrikcijas enzīmi

Table 2

Restriction enzymes

Ferments Ferment	Šķelšanas vieta Restricting place	Koncentrācija (vienības/ml) Concentration (units/ml)	Īpašības/derīguma termiņš Characteristic/qality guaranteed	Glabāšanas nosacījumi Storage condition
BamHΙ	5'...G//GATC C3' 3'...C CTAG//G ...5'	10	Savs buferis BamHI⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, zvaigznes aktivitāte buferos – B⁺, R⁺, 1x Y⁺/Tango^TM, termālā inaktivācija pie +85°C, augsta koncentrācija, genoms noteikts. 03.2003.	-20^ºC
EcoRΙ	5'...G//AATT C...3' 3'...C TTAA//G...5'	10	Reakcijas buferis O⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, zvaigznes aktivitāte buferī R⁺, termālā inaktivācija pie +65°C, augsta koncentrācija, genoms noteikts, rekombinants enzīms. 06.2003.	-20^ºC
EheΙ	5'...GGC//GCC...3' 3'...CCG//CGG...5'	10	Reakcijas buferis Y⁺/Tango^TM , inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 80 %, zvaigznes aktivitāte, metilācija pie CG, termālā inaktivācija pie +65°C, augsta koncentrācija, genoms noteikts. 03.2003.	-20^ºC
HindΙΙΙ	5'...A//AGCT T...3' 3'...T TCGA//A...5'	10	Reakcijas buferis R⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, daļēja metilācija pie CG, termālā inaktivācija pie +65°C. 04.2003.	-20^ºC
*Kpn2I*	5'...T//CCGG A...3' 3'...A GGCC//T...5'	10	Reakcijas buferis Y⁺, inkubācijas T=+55°C, ligācijas efektivitāte 90 %, daļēja metilācija pie CG, termālā inaktivācija pie +80°C, genoms noteikts, rekombinants enzīms. 04.2003.	-20^ºC
KspAΙ (HpaΙ)	5'...GTT//AAC...3' 3'...CAA//TTG...5'	10	Reakcijas buferis B⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, zvaigznes aktivitāte buferos – G⁺, 1x Y⁺/Tango^TM, daļēja metilācija pie CG, termālā inaktivācija pie +65°C, genoms noteikts. 08.2003.	-20^ºC
PvuI	5'...CG AT//CG...3' 3'...GC//TA GC...5'	10	Reakcijas buferis R⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efktivitāte 90 %, metilācija pie CG, termālā inaktivācija pie +80°C, genoms noteikts.04.2003.	-20^ºC
PvuΙΙ	5'...CAG//CTG...3' 3'...GTC//GAC...5'	10	Reakcijas buferis G⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, zvaigznes aktivitāte buferos – B⁺, 1x, 2x Y⁺/Tango^TM, termālā inaktivācija pie +80°C, augsta koncentrācija, genoms noteikts. 03.2003.	-20^ºC
SalΙ	5'...G//TCGA C...3' 3'...C AGCT//G...5'	10	Reakcijas buferis O⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, zvaigznes aktivitāte, metilācija pie CG, termālā inaktivācija pie +65°C, augsta koncentrācija, genoms noteikts. 05.2003.	-20^ºC
ScaI	5'...AGT//ACT...3' 3'...TCA//TGA...5'	10	Reakcijas buferis ScaI⁺, inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 80 %, zvaigznes aktivitāte, termālā inaktivācija pie +80°C, genoms noteikts. 12.2002.	-20^ºC
*SspI*	5'...AAT//ATT...3' 3'...TTA//TAA...5'	10	Reakcijas buferis G+ inkubācijas T=+37°C, ligācijas efektivitāte 90 %, zvaigznes aktivitāte, termālā inaktivācija pie +65°C, genoms noteikts. 11.2002.	-20^ºC

Ražotājfirma MBI, Fermentas, Lietuva

Restrikcijas buferi (MBI, Fermentas, Lietuva):

v Buffer Y⁺/Tango^TM (ar BSA):

33 mM Tris-acatāts (pH 7,9);

10 mM Mg-acetāts;

66 mM K-acetāts;

0,1 mg/ml BSA

v Buffer O^+:

50 mM Tris-HCl (pH 7,5);

10 mM MgCl₂;

100 mM NaCl;

0,1 mg/ml BSA

v Buffer B⁺:

10 mM Tris-HCl (pH 7,5);

10 mM MgCl₂;

0,1 mg/ml BSA

v Buffer G+:

10 mM Tris-HCl (pH 7,5);

10 mM MgCl₂;

50 mM mg/ml BSA

v Buffer R⁺:

10 mM Tris-HCl (pH 8,5);

10 mM MgCl₂;

100 mM KCl;

0,1 mg/ml BSA

Klenov fragments (DNA Polymerase Ι Large Fragment (Klenow Fragment) (MBI, Fermentas, Lietuva):

T4 DNS ligāze, T4 DNS polimerāze, Taq DNS polimerāze (MBI, Fermentas, Lietuva)

4. DNS lādētājs

6x Mass Loading Dye Solution (MBI, Fermentas, Lietuva):

0,09 % bromfenolzilais

60 % glicerols

60 mM EDTA

5. Marķieri

DNS elektroforēzē #SM 0311 Lot VA22 (MBI, Fermentas, Lietuva)

6. Mikroorganismu celmi

Baktērijas – Escherichia coli DH5a, SURE, XL1 no laboratorijas kolekcijas

7. E.coli plazmīdas

¨ pJIT – 60 (Olivier Voinnet, Yvonne M. Pinto, and David C. Baulcombe, The Sainsbury Laboratory, John Innes Centre, Norwich NR4 7UH, United Kingdom)

¨ pXL 3-4 (Tiina Tamm and Erkki Truve, Institute of Chemical Physics and Biophysics and Gene Technology Centre, Tallinn Technical University, EE12618 Tallinn, Estonia)

¨ p3-4K5’ (šajā darbā konstruēta);

¨ pXL 3-4K (šajā darbā konstruēta);

¨ pJIT–CfMV–1 (šajā darbā konstruēta);

¨ p34-2x35S (šajā darbā konstruēta)

8. Mikroorganismu kultūru audzēšana

(Pēc Current Protocols in Molecular Biologi, Absubel, F.M. et. al, 1988)

8.1. E.coli audzēšana šķidrā barotnē:

¨ Šķidro barotni 2x TY ielej 3 ml mēģenē (V=20ml);

¨ Pievieno ampicilīnu (100mg/ml), samaisa;

¨ Ar sterilu cilpiņu no Perti plates paņem vienu atsevišķu koloniju un ienes mēģenē ar barotni;

¨ Inkubē 16h uz kratītāja 140 apgr/min pie 37°C

8.2. E.coli audzēšana uz Perti plates:

¨ Izkausē LB barotni;

¨ Ielej sterilā stobriņā 20 ml šķidro LB barotni (T=+90°C), pievieno ampicilīnu (100mg/ml) (vai citu antibiotiku), samaisa;

¨ Barotni ielej Petri platē, atstāj, lai tā sacietē;

¨ Kad barotne ir sacietējusi, tad uz tās uzsēj šūnas un ar sterilu stikla spieķīti izlīdzina, nožāvē;

¨ Inkubē 12h termostatā pie 37°C

9. Plazmīdu izolēšana no E.coli (Minipreps)

(Adaptēts pēc QIAGEN Plasmid Purification Handbook, 11/98)

¨ No mēģenes uz “ependorfa” stobriņu pārnes 1,5 ml kultūras

¨ Centrifugē 1 min pie 13 200 apgr/min

¨ Supernatantu nolej, nogulsnes izšķīdina 300 ml lizēšanas P1 buferī, vorteksējot:

50 mM Tris (pH 8,0)

10 mM EDTA

100 m/ml RNase A

¨ Pievieno 300 ml lizēšanas P2 buferi:

200 mM NaOH

1 % SDS

Lieto šūnu lizēšanai. NaOH atrauj no membrānas Ca⁺ jonus un sagrauj membrānu. Viegli samaisa nevorteksējot, lai hromosomālā DNS paliktu pie membrānas proteīniem. Atstāj uz 4 min RT (istabas temperatūrā)

¨ Pievieno 50 ml CHCl₃ proteīnu molekulu denaturēšanai, lai miniprepā būtu pēc iespējas mazāk proteīnu

¨ Pievieno 300 ml P3 buferi (3 M Kālija acetāts, pH 5.2), viegli samaisa nevorteksējot

¨ Centrifugē 10 min pie 13 200 apgr/min, RT

¨ Supernatantu pārnes jaunā stobriņā, pievieno 700 ml izopropanola, viegli samaisa, centrifugē 10 min pie 10 000 apgr/min, +4°C

¨ Supernatantu nolej, tad nogulsnes mazgā ar 700 ml 70 % etanola, centrifugē 10 min pie 13 200 apgr/min, RT

¨ Nolej supernatantu, nogulsnes žāvē 10 min, RT pie ventilatora

¨ Nogulsnes izšķīdina 50 ml dH₂O

Ja nepieciešams ļoti tīrs minipreps:

¨ Izšķīdinātajām nogulsnēm pievieno vēl 50 ml dH₂O un 5 ml 1 M Tris pH 8,0

¨ Pievieno 16 ml hloroforma un 16 ml fenola šķīduma, vorteksē, atstāj uz 5 min, tad atkal vorteksē, centrifugē 4 min pie 13 200 apgr/min

¨ Pārnes supernatantu jaunā stobriņā, pievieno 1/10 tilpuma vienības P3 buferi (3 M Kālija acatāts, pH 5,2), vorteksē

¨ Pievieno 0,8 tilpuma vienības izopropanola, samaisa, centrifugē 5 min pie 13 200 apgr/min

¨ Nolej supernatantu

¨ Nogulsnes žāvē 15 min, RT pie ventilatora

¨ Nogulsnes izšķīdina 20 ml dH₂O

10. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)

pXL 3-4 CfMV cDNS 5’ gala amplifikācija, lai iegūtu restrikcijas saitu ar KspAI, ko tālāk izmantos jaunu konstrukciju veidošanai.

EheI KspAI

5’ gat ctt aat GGC GCC GTT AAC gat aat agt gcg aag 2.296 (F praimeris)

BamHI

5’ cgc tca cta GGA TCC cca tac ata tc 1.10 (R praimeris)

(Pēc MBI, Fermentas protokola #EP0401)

PCR reakcijas maisījums (100 ml)

¨ 10x PCR buferis + (NH₄)₂SO₄ – 10 ml

¨ 10 mM dNTP mix – 2 ml

¨ Praimeris 1.10 (1 mM) – 0,5 ml

¨ Praimeris 2.296 (1 mM) – 2 ml

¨ Plazmīdas DNS (0,1 mg)- 1 ml

¨ 10x MgCl₂ (25 mM) – 10 ml

¨ Taq DNA polimerāze – 1 ml

¨ Sterils dH₂O 100ml

Termosaiklerim Eppendorf iestāda sekojošu programmu (30 cikli):

1. Denaturācija pie + 95°C 2 min

2. Praimera un DNS matricas saistīšanās pie + 45°C 30 sec

3. DNS ķēdes elognācija pie + 72°C 1 min

4. Denaturācija pie + 95°C 30 sec

11. Restrikcija

Restrikcijas maisījums:

¨ Plazmīdas DNS dH₂O šķīdumā 0,1 – 5 ml

¨ Restikcijas bufera (MBI, Fermentas, Lietuva) 2ml

¨ Restriktāzes (MBI, Fermentas, Lietuva) 1ml

¨ H₂O 20 ml

¨ Inkubē 3h pie + 37°C

12. Daļējā restrikcija

¨ Trijos “ependorfa” stobriņos sagatavo restrikcijas maisījumus bez restriktāzes, gatavo tā, lai veidotos koncentrācijas pirmajā stobriņā – 1,5, otrajā – 1, trešajā – 0,5

¨ Ieliek stobriņus ledū (+ 4°), 100 ml sadala uz trim stobriņiem – pirmajā – 50 ml, otrajā – 33 ml un trešajā – 17 ml

¨ Pirmajam stobriņam pieliek 1 ml restriktāzes, samaisa

¨ No pirmā stobriņa uz otro pārnes 17 ml šķidruma un samaisa

¨ No otrā stobriņa uz trešo pārnes 17 ml šķidruma un samaisa

¨ Inkubē 15 min pie + 37°C

¨ Lai apturētu reakciju, pieliek klāt 1,65 ml 0,5 M EDTA

¨ Analizē un izolē no 0,7 % agarozes gēla

13. Ligācija

¨ Vektors 1,0 – 7,0 ml

¨ Fragments 1,0 – 7,0 ml

¨ Ligāzes buferis (MBI, Fermentas, Lietuva) 2ml

¨ T4 Ligāze (MBI, Fermentas, Lietuva) 1ml

¨ H₂O 20 ml

¨ Inkubē 16h pie + 16°C

14. DNS fragmentu 5’ galu aizpildīšana ar Klenova fragmentu

¨ Ņem restrikcijas reakcijas šķidrumu pēc restrikcijas, kas būs jāaizpilda ar Klenow fragmentu (MBI, Fermentas, Lietuva). Šķidruma tilpums - 50 ml

¨ Pievieno 1 ml Klenow feragmentu

¨ Pievieno 2,5 ml 2 mM dNTP mix (MBI, Fermentas, Lietuva), kura beigu koncentrācijai ir jābūt 0,05 mM

¨ Inkubē 10 min pie + 37°C

¨ Inaktivē reakciju, inkubējot 10 min pie + 70°C

15. E.coli šūnu transformācija

(Adaptēts pēc Grey M., et. al, 1992)

¨ Ligācijas maisījumu inkubē 5 min pie + 65°C

¨ 200 ml E.coli DH5a kompetento šūnu atkausē uz ledus

¨ Sadala divos “ependorfa” stobriņos, katrā pa 100 ml šūnu

¨ Pievieno 10 ml ligācijas maisījuma, inkubē uz ledus 10 min

¨ Inkubē termostatā pie + 42°C 2 min, tad pārnes uz ledus uz 10 min

¨ Pievieno 1 ml SOC barotnes

¨ Liek inkubēties 1h pie + 37°C termostatā

¨ Transformētās šūnas (200 ml) izsēj uz Petri plates ar agarizēto LB barotni (25 ml) ar pievienotu ampicilīnu (100mg/ml) vai citu antibiotiku

16. DNS fragmenta ekstraģēšana no gēla

(Pēc ekstrakcijas kita #K0513 protokola, MBI, Fermentas, Lietuva)

¨ Nosver tukšu, sterilu “ependorfa” stobriņu

¨ Vajadzīgo DNS fragmentu izgriež ar skalpeli no 0,7 % agarozes gēla uz UV – iluminatora

¨ Fragmentu ievieto “ependorfa” stobriņā un nosver

¨ Pievieno 0,5 tilpuma vienības TBE konversijas buferi un 4,5 tilpuma vienības NaJ šķīduma

¨ Karsē 5 min pie + 55°C

¨ Pievieno 5 ml labi sajauktu stikla pulvera suspensiju (Silicia Powder Suspension (MBI, Fermentas, Lietuva)), vorteksē

¨ Inkubē 5 min pie + 55°C

¨ Patur 5 min RT, ik pa brīdim apmaisot

¨ Cenrtifugē 30 sec pie 13 200 apgr/min

¨ Supernatantu nolej, nogulsnes mazgā trīs reizes ar “DNS wash” buferi (MBI, Fermentas, Lietuva) – pirmajā reizē mazgā ar 600 ml “DNA wash” šķīdumu, otrajā ar 400 ml un trešajā ar 200 ml. Katras mazgāšanas reizē nogulsnes rūpīgi suspendē vorteksējot, centrifugē 30 sec pie 13 200 apgr/min

¨ Nogulsnes žāvē 10 min, RT pie ventilatora

¨ Nogulsnes izšķīdina 25 ml dH₂O

¨ Inkubē 5 min pie + 55°C

¨ Centifugē 5 sec pie 13 200 apgr/min, supernatantu pārnes jaunā, sterilā “ependorfa” stobriņā un analizē uz 0,7 % agarozes gēla

17. DNS sekvenēšana

(Applied Biosystems, Primer Cycles Sequensing Kits, ABI PRISM, Big Dye)

5’ gat ctt aat gc gcc gtt aac gat aat agt gcg aag 2.296 (F praimeris)

5’ cgc tca cta gga tcc cca tac ata tc 1.10 (R praimeris)

Sekvenēšnas buferis (1/4):

¨ Big Dye reakcijas buferis – 2 ml

(satur Big Dye praimerus, dNTP’s, AmpliTaq – fermentus, reakcijas buferi)

¨ 5x reakcijas buferis pH 9,0 – 3 ml

¨ Praimeris 1,6 pmol

¨ Plazmīdas DNS – 250 ng

¨ H₂O 20 ml

5x reakcijas buferis pH 9,0:

¨ 400 mM Tris

¨ 10 mM MgCl₂

PCR programmas iestādīšana (30 cikli):

1. Sasilšana līdz + 96°C

2. + 96°C 10 sec

3. Atdzišana līdz + 50°C

4. + 50°C 5 sec

5. Sasilšana līdz + 60°C

6. + 60°C 4 min

17.1. DNS attīrīšana pēc PCR (250 ng)

¨ Pievieno 16 ml H₂O un 64 ml 96 % auksta (- 20°C) etanola

¨ Inkubē 15 min RT

¨ Centrifugē 10 min pie 12 000 apgr/min

¨ Uzmanīgi ar pipeti nosūc supernatantu

¨ Nogulsnēm pievieno 250 ml auksta (-20°C) 70 % etanola

¨ Centrifugē 10 min pie 12 000 apgr/min

¨ Ar pipeti nosūc supernatantu

¨ Nogulsnes žāvē pie + 55ºC - + 65°C