“Genomic DNA Purification Kit #K0512” – “Fermentas” (Lietuva)

• Līzes buferis
• Precipitācijas šķīdums
• NaCl šķīdums

“Taq DNA Polymerase (reombinant) #EP0402” – “Fermentas”(Lietuva)

• 10x PCR buferis
• 10x PCR buferis ar (NH₄)₂SO₄
• 25 mM MgCl₂
• Taq polimerāze

“dNTP 10 mM Solution” – “Fermentas”(Lietuva)

DNS garuma standarts “pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker #SM0221” – “Fermentas” (Lietuva)

SDS – “Sigma”(ASV)

EDTA – “Serva” (ASV)

Etanols 96⁰ – “Enola” (Latvija)

Agaroze – “Aire”(Igaunija)

HCl – “Reahim” (Krievija)

HNO₃ 65%– “Reahim” (Krievija)

AgNO₃ – “Reahim” (Krievija)

NaOH – “Reahim” (Krievija)

Na₂CO₃ – “Reahim” (Krievija)

NaCl – “Reahim” (Krievija)

Fenols – “Reahim” (Krievija)

Hloroforms – “Reahim” (Krievija)

Izoamilspirts – “Reahim” (Krievija)

Glicerīns – “Reahim” (Krievija)

Akrilamīds – “Biorad” (ASV)

Bis-akrilamīds – “Biorad” (ASV)

TEMED – “Biorad” (ASV)

APS – “Biorad” (ASV)

Bromfenolzilais – “Sigma”(ASV)

Ksilēna cianols – “Sigma”(ASV)

0,5 M EDTA – 186 g EDTA šķīdina 800 ml H₂O; titrē ar 10 M NaOH līdz pH 8; uzpilda ar H₂O līdz 1000 ml.

2 M Tris-Cl pH 7,5 – 242 g Tris bāzes izšķīdina 700 ml H₂O; titrē ar HCl līdz pH 7,5; uzpilda ar H₂O līdz 1000 ml.

2 M Tris-Cl pH 8 – 242 g Tris bāzes izšķīdina 700 ml H₂O; titrē ar HCl līdz pH 8; uzpilda ar H₂O līdz 1000 ml.

5 M NaCl:

NaCl 29,23 g

H₂O uzpilda līdz 100 ml

TE buferis: 10 mM Tris-Cl pH 7,5; 1 mM EDTA

2 M Tris-Cl pH 7,5 5 ml

0,5 M EDTA 2 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

PKLB: 10 mM Tris-Cl pH 8,0; 25 mM EDTA; 200 mM NaCl

2 M Tris-Cl pH 8,0 5 ml

0,5 M EDTA 50 ml

5 M NaCl 40 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

50x TAE buferis: 2 M Tris-acetāts; 50 mM EDTA

Tris bāze 242 g

Etiķskābe (ledus) 57,1 ml

0,5 M EDTA 100 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

0,5x TAE buferis:

50x TAE buferis 10 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

10x TBE buferis: 0,9 M Tris-borāts; 20 mM EDTA

Tris bāze 108 g

Borskābe 55 g

0,5 M EDTA 100 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

1x TBE buferis:

10x TBE buferis 100 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

0,5x TBE buferis:

10x TBE buferis 50 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

10000x etīdija bromīda šķīdums:

Etīdija bromīds 50 mg

H₂O 10 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

Ph:Chl:IA: attiecība 25:24:1

Fenols 50 ml

Hloroforms 48 ml

Izoamilspirts 2 ml

GLB:

Bromfenolzilais 10 mg

0,5 M EDTA 0,2 ml

H₂O uzpilda līdz 10 ml

Den. GLB:

Bromfenolzilais 10 mg

0,5 M EDTA 0,2 ml

Etanols 96⁰ 22,5 ml

Glicerīns 7,5 ml

H₂O 120 ml

10% SDS:

SDS 10 g

H₂O 90 ml

10% APS:

APS 0,5 g

H₂O 4,5 ml

H₂O 60 ml

H₂O 98 ml

Etanols 70⁰:

Etanols 96⁰ 730 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

10% etanols:

Etanols 96⁰ 105 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

10% etiķskābe

Etiķskābe (ledus) 100ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

1% HNO₃:

65% HNO₃ 10 ml

H₂O uzpilda līdz 1000 ml

24 mM AgNO₃:

AgNO₃ 820 mg

H₂O uzpilda līdz 200 ml

Attīstītājs a (280 mM Na₂CO₃; 0.044% formalīns):

Na₂CO₃ x 10 H₂O 80 g

Formalīns 1,2 ml

Dejonizēts H₂ O uzpilda līdz 1000 ml

Attīstītājs b (70 mM Na₂CO₃; 0,044% formalīns):

Na₂CO₃ x 10 H₂O 20 g

Formalīns 1,2 ml

Dejonizēts H₂ O uzpilda līdz 1000 ml

Attīstītājs c (200 mM NaOH; 0,055% formalīns):

10 M NaOH 20 ml

Formalīns 1,5 ml

Dejonizēts H₂ O uzpilda līdz 1000 ml

Attīstītājs d:

Pirmais šķīdums (375 mM NaOH; 0,01% formalīns):

10 M NaOH 37,5 ml

Formalīns 2,8 ml

Dejonizēts H₂ O uzpilda līdz 1000 ml

Otrais šķīdums (91 mM Na₂CO₃):

Na₂CO₃ x 10 H₂ O 26 g

Dejonizēts H₂ O uzpilda līdz 1000 ml

Attīstītājs (lielajam gelam)

Pirmais šķīdums (200 mM NaOH; 0,055% formalīns)

NaOH 8 g

Formalīns 1,5 ml

Dejonizēts H₂O uzpilda līdz 1000 ml

Otrais šķīdums (100 mM NaOH; 0,055% formalīns)

NaOH 4 g

Formalīns 1,5 ml

Dejonizēts H₂O uzpilda līdz 1000 ml 

Termobloks -PEA-3002U, ”Labotek” (Latvija)

Centrifūgas – Force 7, “Techne” (Lielbritānija)

Vorteksfūga – 4TE, “Labotek” (Latvija)

Barošanas bloks – 160/1.6, “Bio-Rad”, ASV; un IPE-600-0.5 (Krievija)

Elektriskie svari – 430-33, “KERN” (Vācija)

Spektrofotometrs – 100-20, “HITACHI” (Japāna)

Ūdens dejonizētājs – milli-R/Q, “Millipore” (ASV) 

Genomiskā DNS tika izdalīta no asinīm pēc divām dažādām metodēm, kuras tika apzīmētas kā A un B.

Katrā stobriņā (EDTA Vacutainer) ir 7 ml perifēro venozo asiņu. Sākums abām metodēm ir vienāds.

A metode

1. Stobriņus ar asinīm centrifugē pie 300 g un pēc tam nosūc plazmas slāni.
2. Iepilda 1,5 ml stobriņā 400μl līzes bufera (MBI Fermentas, Genomiskās DNS izdalīšanas komplekts #K0512), pievieno 200 μl no kodolainajβm asins šūnām bagāta slāņa (slānis eritrocītu frakcijas virspusē).
3. Iesaldē, - 20⁰C 15 min
4. 15 minūtes tur 65⁰C šūpotājā
5. Pievieno 600µl hloroforma un vorteksē
6. Centrifugē 5 minūtes 5000 g.
7. Sagatavo percipitācijas šķīdumu: 720µl ūdens un 80µl 10x precipitācijas šķīduma (MBI Fermentas, Genomiskās DNS izdalīšanas komplekts #K0512).
8. Percipitācijas šķīdumam pievieno centrifugāta ūdens fāzi (augšējo), un maisa invertējot 1 – 2 minūtes.
9. a) Ja nogulsnes vājas, centrifugē 5 min 5000 g, supernatantu nosūc un uz nogulsnēm uzlej 100µl 1,2M NaCl (istabas t⁰);

2. Ja nogulsnes labi saskatāmas, tās pārnes jaunā stobriņā bez centrifugēšanas, un šķīdina 100µl 1,2 M NaCl (30 – 60 minūtes), vai atstāj pa nakti. (istabas t⁰.)

1. Kad nogulsnes pilnībā izšķīdušas, pievieno 300µl auksta etanola, samaisa invertējot un izgulsnē DNS, turot 10 minūtes –20^0C; ja nogulsnes veidojas uzreiz un ir labi saskatāmas – istabas temperatūrā.
2. a) Nogulsnes (DNS) pārnes stobriņā ar 1 ml 70⁰C etanolu, skalo;

2. Ja nogulsnes vājas, centrifugē 5 minūtes 5000 g, supernatantu nosūc un uzlej 1 ml 70⁰ etanola skalošanai.

1. DNS pārnes stobriņā ar skrūvējamu vāku un šķīdina 200µl ūdens. Atstāj vismaz uz vienu nakti 4⁰C
2. Ja pēc 2 – 3 stundām vai nākošajā dienā šķīdums ir stipri viskozs, pieliek vēl 200µl ūdens; vajadzības gadījumā to atkārto vairākas reizes.

B metode

3. Eritrocītiem, kas palikuši no 2. punkta pēc virsslāņa noņemšanas, uzlej TE buferi līdz tilpumam 7 ml un apmaisa, sajaucot eritrocītu slāni, sākas eritrocītu osmotiska lizēšanās.
4. 10 minūtes centrifugē pie 300 g, supernatantu nolej.
5. Atkārto 14. un 15. soli līdz nogulsnes vairs tikai viegli sārtas.
6. Nogulsnēm uzlej 1ml PKLB, uzduļķo, pieliek 75µl 10% SDS, samaisa, tad 5µl proteināzi K (20 mg/ml).
7. Ievieto 65⁰C uz šūpotāja un atstāj pa nakti, vai uz 3 – 4 stundām.
8. Pievieno 1 ml Ph:Chl:IA un vorteksē.
9. Centrifugē – 10 minūtes pie 300 G.
10. Ūdens fāzi – augšējo – nosūc un pārnes jaunā stobriņā. Jāuzmanās, lai klāt nepaņemtu citu fāzi.
11. Jaunajam stobriņam pievieno aptuveni 45 µl (1/25 no tilpuma, kas ir stobriņā) 5 M NaCl, un 2,5 ml (2 reizes lielāku tilpumu nekā stobriņā) etanolu.
12. Apmaisa invertējot.
13. a) Ja nogulsnes vājas, centrifugē 5 minūtes 3000 g, supernatantu nosūc, uzlej 2 – 3 ml 70⁰ etanola un skalo;

b) Ja nogulsnes labi saskatāmas, tās pārnes stobriņā ar 1 ml 70⁰ etanolu un skalo.

14. DNS pārnes stobriņā ar skrūvējamu vāku un šķīdina 200 µl, atstājot pa nakti 4⁰C.
15. Ja pēc 2 – 3 stundām vai nākošajā dienā šķīdums ir stipri viskozs, pieliek vēl 200µl ūdens, vajadzības gadījumā to atkārto vairākkārt.

Izdalītās DNS daudzumu un tīrību nosaka spektrofotometriski, izdarot mērījumus pie l = 260 nm un l = 280 nm. Kvarca kivetē iepilda 1 ml H₂O un pievieno 5 ml iegūtā DNS šķīduma, samaisa un nolasa optisko blīvumu. Aprēķinus veic pieņemot, ka šķīdumā ar OD_l260 = 1 o.v. (kivetes biezums l = 1 cm), DNS koncentrācija ir 50 mg/ml. [17] 

Praimeru šķīdumu pagatavošana.

Praimeru oligonukleotīdu sekvences ir:

Kreisās puses praimeris – 5’ – CTCTTTCTGACTCTGCTCA – 3’ (19 nt)

Labās puses praimeris – 5’ – GGAGTTTGCATTCACCTA – 3’ (18 nt)

Uzsintezētie praimeru oligonukleotīdi tika saņemti ūdens šķīdumā ar nezināmu koncentrāciju. PCR maisījuma gatavošanai ērti izmantot praimeru šķīdumus ar koncentrāciju 5 – 10 pmol/ml. Lai nokaidrotu oligonukleotīdu koncentrāciju, tika izmērīts optiskais blīvums pie l = 260 nm. Ielej kvarca kivetē 1 ml H₂O un 10 ml praimera šķīduma. Tālāk var aprēķināt DNS koncentrāciju mg/ml, pieņemot, ka šķīdumā ar OD_l260 = 1 o.v. (kivetes biezums l = 1 cm), vienpavediena DNS koncentrācija ir 37 mg/ml. [17] Tā kā ir zināmas praimeru sekvences un katra nukleotīda molmasas [17], tad ir viegli aprēķināt praimeru oligonukleotīdu molmasas. Zinot molmasu un koncentrāciju mg/ml, var aprēķināt koncentrāciju moli/ml. Lai turpmāk būtu ērtāk veikt aprēķinus no moli/ml pāriet uz pmoli/ml. Aprēķinu rezultāti attēloti 1. tabulā.

1. tabula Praimeru koncentrācijas aprēķini

Aprēķina cik daudz ūdens un cik daudz praimera šķīduma nepieciešams, lai iegūtu nepieciešamo gala koncentrāciju - 5 pmol/ml. Lai būtu vieglāk strādāt, pagatavo abu praimeru maisījumu – praimeru šķīdumus ar koncentrāciju 10 pmol/ml sajauc vienādās daļās. Aprēķina cik daudz ūdens un cik daudz praimera šķīduma nepieciešams, lai pagatavotu šķīdumu ar koncentrāciju 10 pmol/ml. Abus iegūtos praimeru šķīdumus sajauc kopā vienādās daļās un iegūst praimeru maisījumu, kurā katra praimera gala koncentrācija ir 5 pmol/ml. Aprēķini attēloti 2. tabulā.

2. tabula Praimeru šķīdumu pagatavošnas aprēķini.

PCR PRKCB1 gēna 18. eksona amplifikācjai

Tika amplificēts 279 bp garš fragments no PRKCB1 gēna 18. eksona. 2. attēlā attēlota gēna sekvence no gēnu bankas (19). Ar gaiši zilu krāsu iezīmēts fagments, kas tiek sintezēts, bet ar tumši zilu – praimeri. Amplificējamais fragments ietver gandrīz visu 18. eksona kodējošo daļu un vēl 3’ daļu no 17. introna. Ar atkāpēm izdalīta 18. eksona kodējošā daļa.

2. attēls PRKCb1 gēna 18. eksons. Ar dzelenu krāsu iezīmēts fragments, kas tiek sintezēts, bet ar zaļu – praimeri. Amplificējamais fragments ietver gandrīz visu 18. eksona kodējošo daļu un vēl 3’ daļu no 17. introna. Ar atkāpēm izdalīta 18. eksona kodējošā daļa.

Lai veiktu 12 polimerāzes ķēdes reakcijas, vispirms pagatavo reaģentu maisījumu (3. tabula):

3. tabula Reaģentu maisījuma sastāvs 12 PCR reakcijām

Paraugu skaitu, protams, var mainīt. Tādā gadījumā pārrēķina nepieciešamos tilpumus, saglabājot gala koncentrācijas. Iegūto maisījumu kārtīgi samaisa un sadala uz 12 ependorfiem, katrā pa 19 ml. Pirms sadalīšanas, maisījumu īsi nocentrifugē, lai nekādi pilieni nepaliktu pie stobriņa vāciņa vai sieniņām. Katrai PCR pievieno 1 ml DNS šķīduma (50 ng/ml) un kārtīgi samaisa. Ievieto paraudziņus PCR aparātā. Iestāda programmu kāda attēlota 4. tabulā.

4. tabula PCR programma

Kad reakcija beidzas, ependorfus izņem no aparāta un ieliek ledusskapī 4⁰C. Parasti veic arī negatīvo kontroli – vienam no 12 PCR stpbriņiem DNS vietā pievieno 1 ml ūdens. Tas nepieciešams, lai pārliecinātos, ka nav “piesārņojuma”. Ja arī negatīvajā kontrolē tiek iegūts PCR produkts, tad tas liecina, ka kāds no reaģentiem ir piesārņots ar DNS vai reakcijas maisījuma gatavošanas laikā ienests DNS piesārņojums. 

Metode:

• Kolbā ielej 50 ml 0,5x TAE buferi.
• Pieber 0,60 g agarozes.
• Vāra uz elektriskās plītiņas, kamēr agarozes graudiņi vairs nav novērojami.
• Atdzesē līdz aptuveni 40
⁰C.
• Pievieno 3 ml 10000x etīdija bromīda (5 mg/ml).
• Lej uz gela paliktņa, virs kura jau ir uzlikta ķemme un kurš atrodas elektroforēzes aparātā.
• Kad agaroze sabiezējusi, aparātā ielej 0,5x TAE buferi tā, lai tas nedaudz pārklātu gelu.
• Izņem ķemmi.
• Katrā bedrītē iepilda 5 ml PCR produkta, tos vispirms sajaucot ar 1 ml GLB.
• Uzliek aparātam vāku un pieslēdz barošanas bloku, strāvas stiprumu uzstāda ~50-60 mA (spriegums 50 – 70V).
• Elektroforēzi turpina kamēr bromfenilzilās krāsvielas zona sasniedz apmēram 2 – 2,5 cm attālumu no gela pretējās malas.
• Gelu uzmanīgi izņem no vanniņas un uz 5 min iemērc 1x etīdija bromīda šķīdumā.
• Etīdija bromīda šķīdumu nolej un ielej ūdeni, atstāj uz 5 min.
• Skatās gelu UV gaismā un nofotografē. 
• 

Stiklu sagatavošana

1. Stiklus rūpīgi nomazgā ar šķidro mazgāšanas līdzekli “Zilgme”, lietojot sūkli.
2. Stiklus skalo ar krāna ūdeni.
3. Stiklus pārskalo ar destilētu ūdeni un ļauj nožūt.
4. Stiklus pulē:

Kad stikli pilnībā nožuvuši, starp tiem ievieto starplikas (0,4mm) un sastiprina ar klipšiem.

Gela maisījuma pagatavošana:

Pievieno:

(Lietot cimdus!!!)

PCR produktu sagatavošana

PCR produktus vajadzīgā attiecībā sajauc ar Den.GLB (Den.GLB ne mazāk par 50% no kopējā tilpuma). Attiecība atkarīga no DNS koncentrācijas paraugā, parasti 1:1 – 1:6. Pēc tam pārklāj ar minerāleļļas slāni (viens piliens uz stobriņu).

Elektroforēze

Kad gels sapolimerizējies (pēc pāris stundām vai nākamajā rītā) gelu ievieto aparātā:

• Noņem klipšus.
• Izņem apakšas starpliku un ķemmi.
• Ķemmes vietu skalo ar 0,5x TBE no gela paliekām.
• Aparāta gumijas pārkares iesmērē ar vazelīnu.
• Apakšējā kamerā iepilda aptuveni 200 ml 0,5x TBE bufera.
• Spraugu gela apakšā piepilda ar 0,5x TBE buferi.
• Gelu liek aparātā un ar 0,5x TBE buferi piepilda augšējo kameru.
• Ar 1 ml pipeti skalo ķemmes vietu.
• Ieliek ķemmi, tās zarus iedurot 0,5 – 1 mm dziļi gelā.
• Katrā otrajā bedrītē iepilda 0,5 – 1 µl Den.GLB, lai pārbaudītu bedrīšu kvalitāti.
• Ieslēdz preforēzi (~6 mA 200V). Tā iet aptuveni 30 min.
• Preforēzes laikā sagatavotos paraugus denaturē 5 min 95 ^oC temperatūrā. Uzreiz pēc tam liek ledus vannā.
• Pēc preforēzes beigām ar 1 ml pipeti izskalo paraugu bedrītes.
• Uznes paraugus (4µl bedrītē) un DNS garuma standartu.
• Elektroforēze notiek pie 4-6 mA stipras strāas (spriegums 150 – 300V).
• Elektroforēzi turpina kamēr bromfenolzilā krāsviela (tumši zilā līnija) ir izgājusi no gela un ksilēncianols (gaiši zilā līnija) ir veicis attālumu 24 cm (no gela augšas).

Pēc forēzes:

• Izlaiž buferi no augšējās kameras.
• Izņem stiklus no aparāta.
• Atdala stiklus (gels paliek uz mazākā stikla).
• Gelu, kurš atrodas uz mazā stikla, krāso ar sudrabu. 

Stiklu (ar gelu uz augšu) liek dažādos krāsošanai nepieciešamos šķīdumos. Pirms pārnešanas uz nākošo šķīdumu, iepriekšējo notecina. Nepieciešamais šķīduma daudzums ir atkarīgs no vannas formas, bet tam ir jābūt tādā daudzumā, lai tas pārklātu gela virsmu.

1. Mazgā 5-10 min 10% etanolā.

3. 2 x skalo H₂ O (2 x 2 min).

4. Tur 20 min 24 mM AgNO₃. Lai taupītu reaģentu un samazinātu vides piesārņojumu, stiklu ar gelu novieto precīzi horizontāli un uz gela uzlej 150 – 200 ml AgNO₃ šķīduma, nevis mērc gelu vannā ar šo šķīdumu.

5. Īsi (ne ilgāk kā 1 min) skalo H₂O.

6. Attēlu attīsta līdz labai fona/zonu attiecībai lietojot divus nedaudz atšķirīgus attīstītājus. Attīstītājam jābūt svaigi pagatavotam, to gatavo laikā, kad notiek krāsošana ar AgNO₃ – 5. punkts. Vispirms iemērc gelu 1. attīstītājā. Kad parādījušās pirmās zonas, iemērc 2. attīstītājā.

7. Pārtraucējs (fiksāža) 10% etiķskābe, vismaz 10 min.

8. Skalo H₂ O.