Levānsaharāzes darbības mehānisms un raksturojums

   Pirmā publikācija par levānsaharāzes iegūšanu no Zymomonas mobilis ir publicēta 1983. gadā [Doelle et al. 1993]. Levānsaharāze ir konstatēta ne tikai Z. mobilis šūnās, tai ir liela nozīme arī Bacillus subtilis, Aerobacter levanicum, Gluconobacter oxydons un Streptococcus mutans, kā arī vairāku citu baktēriju saharozes metabolismā. Levānsaharāze šķeļ -(2-1) saiti, pārnesot -D fruktozilatlikumu no substrātdonora uz attiecīgo akceptormolekulu, atbrīvojot glikozi [Doelle et al. 1993]. Levānsaharāzes molekula pievienojas pie substrāta un izveidojies fermenta-fruktozes komplekss realizē tālāku secīgu saharozes molekulu pievienošanu, atbrīvojot glikozi un pievienojot fruktozi pie pakāpeniski pieaugošās polimēra ķēdes. Tādejādi levānsaharāze realizē fruktozes vienību pārnesi no saharozes uz akceptoru, kas šajā gadījumā ir augošā polifruktozīda ķēde. Iespējami gadījumi, kad akceptors ir saharoze vai ūdens. Tad, attiecīgi, reakcijas produkti ir glikoze un fruktoze vai oligomēri.
   Jaunākajā literatūrā ir norādes, ka levānsaharāzei ir vismaz divi aktīvie centri un ķīmiskas modifikācijas. Temperatūras vai ģenētisku manipulāciju rezultātā ir iespējams selektīvi inhibēt polimērāzes aktivitāti, saglabājot hidrolītisko aktivitāti [Sangiliyandi et al. 2001].
   Levānsaharāžu īpašības ir atšķirīgas ne tikai dažādām baktēriju ģintīm, bet arī vienas sugas robežās. Bacillus circulans levānsaharāzes darbības pH un temperatūras optimums ir pH 5-7 un 40ºC. Tas ir ekstracelulārs, inducējams ferments [Oseguera et al. 1996]. Acetobacter diazotrophicus levānsaharāze raksturota kā konstitutīvs ferments ar optimālo aktivitāti pie pH 5.0. Attīrīts ferments sastāv no viena 58 kDa polipeptīda ar izolelektrisko punktu pie pH 5.5 [Hernandez et al. 1995]. No Rahnella aquatilis JCM-1683 bezšūnu ekstrakta izdalītā un attīrītā levānsaharāze sastāv no divām identiskām apakšvienībām ar molekulmasu 64 kDa. Aktivitātes optimums ir pie pH 6.0 un 55 - 60ºC [Ohtsuka et al. 1992]. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola levānsaharāzes molekulmasa ir 68 kDa, maksimālā aktivitāte ir pie pH 5.8-6.6 un 60ºC un veidotā levāna molekulmasa ir atkarīga no temperatūras, sāļu un saharozes koncentrācijas [Hettwer et al. 1995].
   Pēc dažu pētnieku datiem Z. mobilis levānsaharāzes optimālais pH intervāls ir pH 5 rajonā un 75% no levānsaharāzes aktivitātes atrodas šūnā [Viikaari 1984], taču ir arī norādes uz to ka lielākā daļa levansaharāzes aktivitātes ( 63-93 %) lokalizējas ārpus šūnas [Preziosi et al. 1989]. Crittenden and Doelle (1994) informē par levānsaharāzi kā vienīgo Z. mobilis UQM 2716 ekstracellulāro saharāzi, kas ir atbildīga par saharozes hidrolīzi, levāna un oligosaharīdu veidošanos. Šī fermenta pH optimums ir 5.5 un Mihaelisa konstante Km=64 mM . Levāna veidošanās ir termiski labila un pilnībā inhibējas pie temperatūras augstākas par 35ºC, kura tomēr neietekmē saharozes hidrolīzi un fruktooligosaharīdu veidošanos, ar optimumu pie 45ºC [Crittenden and Doelle 1994]. Levāna sintēzei ar Z. mobilis 113S, kā optimāla temperatūra norādīta 25ºC un pH 4.8 [Bekers et al. 1990]. Saharozes koncentrācija būtiski ietekmē akceptora tipu tranfruktozilēšanas reakcijā. Pie zemas saharozes koncentrācijas noteicošā ir saharozes hidrolīzes reakcija, savukārt pie augstas saharozes koncentrācijas galvenokārt tiek katalizēta oligosaharīdu veidošanās [Crittenden and Doelle 1994 ]. Ir dati, ka galvenais oligosaharīds (98 % no kopējiem oligomēriem ), ko veido Z. mobilis levānsaharāze ir 1-kestotrioze [Crittenden and Doelle 1993].
   Kā viena no perspektīvākajām metodēm fruktooligosaharīdu producēšanā, izmantojot Z. mobilis kultūras, tiek atzīts imobilizācijas process. 1999. gadā Āhenas Universitātes zinātnieku grupa [Marx et al. 2000] veica pētījumus, imobilizējot levānsaharāzi uz dažādiem nesējiem: jon-apmaiņas, stikla, algināta un sveķiem. Rezultāti parādīja, ka visaugstākie aktivitātes, stabilitātes un imobilizācijas efektivitātes rādītāji bija Ca-algināta lodītēs iesaistītiem fermentiem. Šīs lodītes bioreaktorā uzrādīja stabilitāti virs 100 stundām.
   Ir dati par levānsaharāzes aktivitātes palielināšanos imobilizējot to uz Ca fosfāta gela virsmas [Chambert and Petit-Glatron 1993]. Levāna ražošanā var izmantot levānsaharāzi, kas imobilizēta uz keramikas materiāla [Iizuka 1993].
   Vigants et al. (2001) apraksta vienkāršu un efektīgu izstrādātu Z. mobilis ATCC membrānsaistītās levānsaharāzes attīrīšanas metodi, kas nodrošina fermenta tīrību no pārējām šūnas brīvajām vielām. Metodes pamatā ir levānsaharāzes izgulsnēšana ar 0.1 M MnCl2 no dezintegrētu šūnu ekstrakta un homogēna attīrīšana, izmantojot ultrafiltrāciju un jonapmaiņas hromatogrāfiju [Vigants et al. 2001].
   Ir atrodami samērā maz dati par levānsaharāzes aktivitāti ietekmējošiem savienojumiem. Konstatēts, ka Z. mobilis levānsaharāzes aktivitāti in vitro 5 mM koncentrācijās neinhibē divvalentie katjoni : Ba2+; Zn2+; Hg2+; Ca2+ , Cu2+. Vairāki nemetabolizējamie cukuri (laktoze, galaktoze, maltoze un citi) neietekmē levānsaharāzes aktivitāti. Daļēji attīrītu levānsaharāzi var aktivizēt ar 5 mM fruktozo 1,6-fosfātu, aspartāmskābi un glikozoamīnhidrohlorīdu. Inhibīcija novērota ar mannozi, kuras 0.7 mM koncentrācija izraisa 50% un 5 mM koncentrācija 100% levansaharāzes aktivitātes samazināšanos. Inhibējošs efekts uz levānsaharāzi ir arī 6-fosfoglikonātam, glikozei un etanolam [Lyness and Doelle 1983]. Tomēr ir arī dati, ka etanola koncentrācija ap 70 g/l nesamazina, pat veicina levāna sintēzi ar Z. mobilis 113S šūnām [Bekers et al. 1990 ].
   Ir pētītas līdzsvara izmaiņas starp Bacillus subtilis levānsaharāzes hidrolīzes un sintēzes aktivitātēm, aizstājot ūdeni ar dažādiem organiskajiem šķīdinātājiem fermentācijas vidē. Pie augstām šo šķīdinātāju koncentrācijām, ferments uzrādīja tikai sintēzes aktivitāti. Levānam, ko ieguva pie sekojošiem nosacījumiem, molmasa bija ap 106 un tas uzrādīja zemu molekulāro dispersiju [Chambert and Petit-Glatron 1989].
   Vēl nav pilnībā izpētīts, cik stipri oligofruktānu veidošanos ar dažādām Z. mobilis kultūrām iespaido procesa fizikālie parametri. Ilgstoši pētījumu apliecināja, ka oligomēru veidošanos ar Z. mobilis strauji palielinās pie pH 6.0 un pie palielinātas saharozes, glikozes un fruktozes koncentrācijas [Viikari et al. 1986; Doelle et al. 1993]. Arī paaugstināta temperatūra ir oligomēru veidošanās veicinošs faktors [König et al. 1998 ].