METODIKA UN MATERIĀLI.
Materiāli
6, 24, 96 - aiļu plates - Nunc , Denmark
50 ml ( 25 cm²) plastmasas flakoni - Strastedt , Denmark
15 ml , 50 ml stobriņi - Nunc , Denmark
Stobriņi šūnu sasaldēšanai ( crystubes) - Nunc, Denmark
Automātiskās pipetes - Biohit Oyj ,Finland
Vienreizējas lietošanas cimdi - TROGE,TRO-sensoft ,Germany
maska - Ulma Gmb&Co , Germany
Aparatūra Termostats -U10, GDR Inversais mikroskops - Labovert FS type 090-127.012; Ernst Leitz Wetzlar GMBH , Germany
Centrifūga - TYS -375-4260, CCCP
Ledusskapis - N.100887, CCCP
CO 2 inkubators - MC 0176, Sanyo, Japan
Svari - Ohaus, USA Saldējamā kamera - Ultra low, Sanyo, Japan
Pētniecības metodes
2.Vīrusa vairošana .
3.Vīrusa titrēšana .
Darbā tika izmantota daudz slāņainā suņa aknu MDCK epiteliālo šūnu kultūra, kura tika iegūta no Central Pablic Health Laboratory, Respiratory Virus Unit . MDCK kultūras šūnas tika kultivētas Minimal Essental Medium Glutomax (Gibco) barotnē, kurai tika pievienotas 10% govs embriona serums un 100 ml penicilīna 25cm³ plastmasas flakona . No flakona virsmas šūnas tika ņemtas ar maisījumu kas satur 1% tripsīna (Gibco) EDTA, attiecībā1:4, tika pārsētas divas reizes nedēļā 1:4 un inkubētas 37?C temperatūrā .
A gripas vīra štamms A/H3N2/Sydnej/5/97 bija savairots MDCK šūnu kultūrā. Šūnas tika sasētas flakonā 1x105 šūnas/ml koncentrācijā. 24 stundas pēc monosļāņa izveidošanās vide salējās. Lai uzlabotu gripas vīrusa saistīšanos ar šūnu receptorie, šūnas tika skalotas ar fizioloģisko šķidrumu (150M NaCl ) un uz divām stundām tika pārlietas ar MEM, kura satur 1,5 µM/ml tripsina ( Sigma). Pēc divām stundām vide salējās un tika izvietota 0,1 ml vīrusā 1:10 un 1:100 attiecībās. Vīrusu adsorbcija notika 40 minūšu laikā istabas temperatūra. Pēc tam šūnas tika pārlietas ar MEM, kura satur 1,5 µM/ml tripsīna, un 48 stundas inkubējas. Kultivējošā vidē savācās tikai citopatiska efekta klātbūtnē un tika salieta pa flakoniem, bija veikta vīrusa titrēšana. Vīruss tika sasaldēts un glabāts pie - 70?C.
Preparāta antivīrusu aktivitātes noteikšana pēc vīrusa citopātīskā efekta inkubēšanos. MDCK kultūras šūnas tika sētas 96 aiļu platēs (1x105) šūnas/ml. 24 stundas pēc monoslāņa izveidošanās šūnu barotne tika aizvākta, šūnas atmazgātas ar fizioloģisko šķidrumu no barotnes, kas satur serumu. Pēc tam tika pārlietas ar MEM barotni, kas satur 1,5µM/ml tripsīna. Pēc divām stundām vide salējās un katrā ailē, izņemot kontroles audus, tika ievadīts 25µM atbilstošā atšķaidījuma vīruss. Eksperiments noritēja 2 variantos. Pirmajā variantā preparāta klātbūtnē un bez tā tika veikta vīrusa testēšana ( vīrusa kontrole ) . Otrajā - šūnu inficēšanai tika izmantota noteikta vīrusa deva ( 10 TCID50 vai 100TCID50). Pēc inficēšanās pusē no ailēm tika ievadīts preparāts. Vīrusa devas otrais variants ļāva izmantot lielāku aiļu skaitu, kas bija ērtāk priekš rezultāta statistiskās apstrādes. 40 minūtes pēc vīrusa apstrādes puse no ailēm tika pārlieta ar barotni, kas satur 1,5 µM/ml tripsīna un izmeklējamo preparātu, otra puse - ar tādu pašu barotni, bet bez preparāta. Otrajā un trešajā diena 96 aiļu planšetes tika caurskatītas citopātiskā efekta klātbūtne.
Gatavojās 10 kārtās vīrusa atšķaidījumi MEM barotnē. No ailēm izņemas barotne un tika ievadīta 25ml vīrusa. Katrs atšķaidījums četrās ailēs. Istabas temperatūrā, 40 minūšu laikā, periodiski kustinot, vīruss adsorbējās. Pēc tam ailes tika salietas ar barotni, MEM kas satur 1,5 µM/ml tripsīna un trešajā dienā tika caurskatītas citopātiskā efekta klātbūtnē.
Datu apstrādes metodes .
1.Citopātiskā efekta novērtēšana .
2. Vidējo aritmētisko salīdzināšana pēc Stjudenta kritērija.
Citopātiskā efekta novērtēšana.
Lai novērtētu citopātisko efektu, plates ailēs noteica cik ailēs ir citopātiskais efekts vīrusa kontrolē un ar preparātu apstrādātajās ailēs. Iegūtos rezultātus vajag izteikt procentos, atsevišķi vīrusa kontroles ailēm un atsevišķi ar preparātu apstrādātajām ailēm: Kopējais aiļu skaits - 100 % Aiļu skaits, kurās ir citopātiskais efekts - X Citopātiskais efekts % = ( 100% x aiļu skaits , kurās ir citopatiskais efekts ) : kopējais aiļu skaits.
Vidējo aritmētisko salīdzināšana pēc Stjudenta kritērija.
Savstarpēju atkarīgu paraugkopu vidējo aritmētisko salīdzināšanai izmantoju Microsoft Excel datorprogrammu. Lai noteiktu statistisko ticamību 7,8-dihidroneopterīna darbībai pie dažādām devām , aprēķināju ticamības koeficienta rezultātus(Stjudenta kritērija vērtība).Tā kā rezultātu ticamības koeficients t atbilst stjudenta sadalījumam, to salīdzināja ar ta;v . Ja t < ta;v , nulles hipotēze paliek spēkā , bet , ja t > ta;v , salīdzināmo paraugkopu vidējie aritmētiskie atšķīrās būtiski. Tieši pēc tāda paša principā noteicu, ka 7,8-dihidroneopterīns darbojās, ja ievadīt pirms inficēšanas un pēc inficēšanas.