protein_folding

Proteīnu salocīšanās problēmas

Polipeptīdu ķēde līdzīgi kurpju auklām var tikt salocīta daudzos dažādos veidos, taču tikai viens no šiem daudzajiem veidiem ļauj proteīnam pareizi funkcionēt (kurpi var aizsiet, tikai pareizi sasienot kurpju auklas!). Taču ne vienmēr funkcionētspējas trūkums ir ļaunākais scenārijs. Gluži kā bezcerīgi samezglota kurpju aukla var būt sliktāks iznākums nekā nemaz nesasieta aukla, pārāk liels nepareizi salocīta proteīna daudzums var būt kaitīgāks nekā pārāk mazs pareizi salocīta proteīna daudzums. Iemesls tam – nepareizi salocīti proteīni var kaitēt šūnām, kurās tie atrodas.

Daudzu savstarpēji nesaistītu iedzimtu slimību pamatā ir nepareizi salocīti proteīni (t. i., ar savām funkcijām neatbilstošu trešējo un ceturtējo struktūru). Šādas slimības ir cistiskā fibroze, Alcheimera sindroms, emfizēmas iedzimtā forma, liellopu spongiozās encefalopātija (“trako govju” slimība) un pat daži vēža paveidi. Bez tam daudzas problēmas, ar kurām saskaras biotehnoloģijas kompānijas, mēģinot rūpnieciski iegūt cilvēka proteīnus ar baktēriju palīdzību, arī ir saistītas ar kļūdām proteīnu salocīšanās procesa laikā.

Proteīnu salocīšanās nozīme ir atzīta jau daudzus gadus. Apmēram pusgadsimtu atpakaļ Linuss Polings (Linus Pauling) atklāja divus diezgan vienkāršus, regulārus aminoskābju sakārtojuma veidus – α – spirāli un β – plāksni, kuri ir sastopami gandrīz katrā proteīnā. 20. gadsimta sešdesmito gadu sākumā Kristians Anfinsens (Christian Anfinsen) parādīja, ka proteīni salokās paši: ja proteīni tiek atlocīti, tie atkal salokās atpakaļ, iegūstot savu sākotnējo formu; nav vajadzīgs kaut kas tāds, kas tos salocītu vai piedotu formu.

Protams, ne Polings, ne Anfinsens, ne arī komisijas, kas šiem abiem zinātniekiem piešķīra Nobela prēmijas, tajā laikā vēl nenojauta, ka šiem atklājumiem būs tik liela nozīme Alcheimera sindroma vai cistiskās fibrozes izpratnē. Tāpat viņi nevarēja iedomāties to, cik ļoti attīsies biotehnoloģijas industrija. Taču jau tajā laikā zinātnieki saprata, ka dzīvībai tik fundamentāls process kā proteīnu salocīšanās ir ar ļoti lielu praktisku nozīmi.

Anfinsena teorija tika papildināta: dažreiz proteīni salokās nepareizi. Bez tam daži proteīni, kuri tika nosaukti par čaperoniem, neļauj to mērķproteīniem salocīties nepareizi. Šie divi nelielie, bet svarīgie papildinājumi ir ļoti svarīgi, pētot proteīnu nepareizas salocīšanās izraisītās slimības.

Cilvēce jau kopš seniem laikiem ir zinājusi (bet ilgu laiku nezināja, ka ir zinājusi), ka proteīnu salocīšanās var notikt nepareizi. Kad tiek vārīta ola, tās baltumā esošie proteīni atvijās. Bet, kad ola atdziest, proteīni neatgriežas savā sākumstāvoklī. Gluži pretēji, tie veido cietu, nešķīstošu masu. Tā ir nepareiza salocīšanās (misfolding). Kaut ko līdzīgu šim – nešķīstošus proteīnu sakopojumus (“kunkuļus”) - bioķīmiķi bieži novēro mēģeņu apakšējā daļā. Arī tos veido nepareizi salocījušies proteīni.

Vēl nesen tika uzskatīts, ka šie proteīnu sakopojumi ir vienkārši juceklīga un pilnīgi amorfa proteīnu šķiedru masa, kas radusies agregācijas rezultātā. Tie neradīja pētniekiem nekādu lielo interesi. Taču tika noskaidrots, ka šie nepareizas salocīšanās rezultātā radušies agregāti var būt augsti strukturēti.

Jau 20. gadsimta sākumā tika noskaidrots, ka dažas slimības raksturo ekstensīvas proteīnu nogulsnes noteiktos audos. Lielākā daļa šo slimību ir retas, izņemot Alcheimera slimību. Pats Aloīzs Alcheimers atklāja “neirofibrillārus samezglojumus un neirītisku aplikumu” noteiktos savu pacientu smadzeņu apgabalos. Šādi samezglojumi ir vairāk vai mazāk raksturīgi slimībām ar ekstensīvu nervu šūnu bojāeju, savukārt aplikums ir raksturīgs tieši Alcheimera slimībai. Galvenais jautājums, kas atbildēts tikai nesen, bija – vai aplikums izraisa Alcheimera slimību, vai, līdzīgi samezglojumiem, ir tā sekas?

Tālāki pētījumi parādīja, ka neirītiskais aplikums gandrīz pilnībā sastāv no viena proteīna. Liels nešķīstoša proteīna nogulšņu daudzums ap deģenerētām nervu šūnām galu galā bija atslēga šīs slimības izpratnei.

Biotehnoloģijas industrijas attīstība bija tas faktors, kas pamodināja interesi par nešķīstošiem proteīnu sakopojumiem. Daudzus grūti iegūstamus cilvēka proteīnus var ātri un izdevīgi iegūt ar baktēriju palīdzību. Taču bieži atklājās divas lietas: pirmkārt, proteīni, kuriem teorētiski bija jābūt šķīstošiem, izkrita nogulsnēs baktērijās nešķīstošu ieslēgumu veidā; otrkārt, proteīni, kuriem vajadzēja tikt sekretētiem uz ārvidi, tā vietā sakrājās baktēriju šūnu iekšpusē pie šūnapvalka.

Šīs neskaidrās norises lika zinātniekiem pirmo reizi nopietni pievērsties pētījumiem par to, kas notiek nepareizi proteīnu salocīšanās laikā. Vai salocīšanās procesā eksistē specifiski, kritiski starpnieki – daļēji salocījušās ķēdes? Uz šo jautājumu bija īpaši grūti atbildēt – daļēji salocījušās ķēdes nesaglabājas īpaši ilgi, tās sekundes daļā pilnībā salokās. Neskatoties uz to 1980 – to gadu sākumā zinātnieki bija ne tikai ieguvuši skaidrus pierādījumus daļēji salocījušos proteīnu eksistencei, bet arī noskaidrojuši to nozīmi salocīšanās procesā. Pētījumā par liellopu augšanas hormonu tika novērots, ka ne pilnībā salocījušies, ne nesalocījušies proteīni neveido sakopojumus (nav “lipīgi”), taču tas raksturīgs daļēji salocītiem proteīniem – pirmā norāde uz to, kā veidojas nešķīstošie proteīnu “kunkuļi” mēģenēs. Joprojām palika neskaidrs, kādēļ pie noteiktiem apstākļiem šūnās notika nepareiza salocīšanās, bet pie citiem apstākļiem – nē.

1980 – to gadu sākumā tika veikts pētījums par temperatūras jutīgām mutācijām (mutācijas, kas atļauj augšanu pie kādas noteiktas temperatūras, bet ne pie citas - ne) bakteriofāga P22 “astes” proteīnā. Tā kā šis proteīns ir liels, tā salocīšanās procesam ir daudzas stadijas, tādēļ šī sistēma ir piemērota šāda procesa novērošanai. Šī temperatūras jutīgās mutācijas (kas gan ir tikai viena nomainīta aminoskābe) rezultāts pie augstas temperatūras ir nešķīstoša sakopojuma veidošanās. Tā kā šīs salocīšanās kļūdas notika laboratorijas apstākļos augošās šūnās, bija iespējams analizēt to, kas notiek nepareizi salocīšanās procesa laikā.

Tajā laikā tika izteikti minējumi, ka šie mutantie proteīni ir mazāk stabili. Taču, ja mutantajām polipeptīdu ķēdēm ļāva salocīties zemā temperatūrā, bet pēc tam temperatūra tika paaugstināta, mutantie proteīni bija tikpat stabili kā normālie. Izrādījās, ka jutīgs attiecībā uz temperatūru bija daļēji salocītais starpnieks. Augstākās temperatūrās šie starpnieki salīp viens ar otru, tādēļ nevar sasniegt pareizi salocīta proteīna stāvokli.

Tātad tika noskaidrota galvenā problēma daudzu proteīnu salocīšanās procesā – tiem jāiziet caur vairākiem daļēji salocīta proteīna starpstāvokļiem, kuros tie balansē starp iespēju salocīties pareizi un iespēju salipt ar citām molekulām, neiegūstot pareizo konformāciju. Atklājums, ka proteīnu salocīšanās problēmu pamatā ir to starpstāvokļi, nevis paši pilnībā nobriedušie proteīni, pavēra iespēju izprast vairākas iedzimtās slimības.

Vairākas desmitgades pēc Anfinsena atklājumiem Amerikas Nacionālais Veselības institūts (National Institutes of Health) un Nacionālais Zinātnes fonds (National Science Foundation) turpina finansēt izpēti vairākās laboratorijās. Tiek mēģināts noskaidrot kā pilnībā atlocīts proteīns, kas var izvēlēties starp 100 – 1 000 000 potenciāliem salocītiem stāvokļiem, konsekventi salokās tikai vienā no tiem, turklāt izdara to minūšu vai pat sekunžu laikā.

Šai iedzimtajai slimībai raksturīgi perifēro nervu un citu orgānu bojājumi, kurus izraisa amiloīdam līdzīga proteīna izgulsnējumi. Lai gan slimība ir diezgan reta, plaši ģenētiskie pētījumi ir parādījuši, ka slimības cēlonis ir proteīna transtiretīna mutācija. Transtiretīns satur lielu daudzumu β – plākšņu un normāli sastāv no vairākām identiskām polipeptīdu ķēdēm. Amiloīdiskā polineiropātija ir rezultāts jebkurai no vairāk kā 50 dažādām transtiretīna mutācijām, no kurām katra maina vienu aminoskābi. Noskaidrots, ka mutantais transtiretīns ir mazāk stabils viegli skābos apstākļos nekā normālais transtiretīns. Tas ir pretstatā P22 proteīnam, kas salokās lēni, bet pēc salocīšanās iegūst stabilu konformāciju. Turklāt transtiretīna agregācijā iesaistīti nesalocītie monomēri, nevis daļēji salocītie starpnieki kā P22 agregācijas gadījumā.

Cilvēkiem, kas slimo ar šo slimību, organismā ir pietiekami daudz transtiretīna, lai tiktu veikta tā funkcija (tiroīdo hormonu transports). Problēma rodas šī proteīna noārdīšanas laikā, kad tas veido nešķīstošu masu, kas “piesārņo” tos audus, kuros šis proteīns tiek deponēts.

Alcheimera slimība ietekmē apmēram 10 % no 65 gadus vecu cilvēku populācijas un vismaz pusi no 85 gadus vecu cilvēku populācijas. Katru gadu ASV no šīs slimības mirst 100 000 cilvēku, tās ārstēšanas izdevumi sasniedz 82.7 miljardus dolāru.
1991. gadā vairākas pētnieku grupas atklāja, ka indivīdiem ar specifiskām mutācijām amiloīda priekšteča proteīnā Alcheimera slimība attīstījās jau 40 gadu vecumā. Organismā amiloīda priekšteča proteīns tiek pārveidots šķīstošos peptīdos (apzīmē kā Ab). Pie noteiktiem apstākļiem Ab agregē un veido garus pavedienus, kurus nevar noārdīt ar parastajiem organisma “atkritumu aizvākšanas” paņēmieniem. Šie agregāti veido β – amiloīdu, kas rada neirītisko aplikumu Alcheimera slimnieku nervaudos. Līdz ar to ir atbildēts ilgi neskaidrais jautājums: neirītiskā aplikuma nogulsnēšanās ir daļa no slimības attīstības, nevis tās iznākums.

Lai izprastu Ab agregācijas procesu, tika ķīmiski sintezēti 40 aminoskābju gari polipeptīdi. Izmantojot šos fragmentus, tika parādīts, ka tie veido specifisku kodolu, kas ar laiku izveidojas par amiloīdu. Iespējams, pirmā soļa lēnā norise ir iemesls tam, ka Alcheimera slimība sastopama gandrīz tikai veciem cilvēkiem, un mutācijas amiloīda priekšteča proteīnā ļauj amiloīda veidošanās procesam notikt ātrāk un vieglāk.

Tomēr vairumam cilvēku Ab tik un tā ir šķīstošs. Lielākajai daļai to indivīdu, kam attīstās Alcheimera slimība, organismā ir normālā amiloīda priekšteča proteīna forma, kas neatšķiras no to cilvēku proteīna, kuriem šīs slimības nav. Iemesls, kādēļ viena un tā pati Ab forma vienu cilvēku smadzenēs veido agregātus, bet citu – nē, pagaidām vēl ir diezgan neskaidrs, lai gan neseni atklājumi ir piedāvājuši intriģējošu iespēju.

Ir zināms, ka cilvēkiem, kuriem ir sastopami dažādi apolipoproteīna E (apoE) ģenētiskie varianti, ir arī dažādas varbūtības saslimt ar Alcheimera slimību. Salīdzinājumā ar visizplatītāko formu – apoE3, indivīdiem ar apoE4 variantu un daudz lielāka iespējamība saslimt. Šie atklājumi ir īpaši pārsteidzoši, jo apoE ir pazīstams kā daļa no asinīs holesterīnu transportējoša kompleksa. Kā lipīdus transportējošs proteīns varētu būt saistīts ar Alcheimera slimību?

Tiek ziņots, ka in vitro apoE saistās ar Ab un notiek aplikuma tipa β – amiloīda šķiedru veidošanās, turklāt apoE4 šo procesu veic daudz ātrāk nekā apoE3. Savukārt citi pētnieki ir ieguvuši atšķirīgus rezultātus: apoE aizkavē šķiedru veidošanos. Līdz ar to vieni uzskata, ka apoE darbojas kā patoloģisks čaperons, kas sekmē nepareizu salocīšanos, citi – ka tam ir normāla čaperona aizsargājošās īpašības. Jebkurā gadījumā apoE ietekme uz Ab salocīšanos var spēlēt galveno lomu Alcheimera slimības attīstībā.

Iespējams, visinteresantākais nepareizas proteīnu salocīšanās izraisītas slimības piemērs ir “trako govju” slimība un tās analogs cilvēkam, Kreicfelda – Jākoba slimība. Šīs slimības, kā arī to paveids aitām, ko pazīst kā skrāpiju (scrapie), jau daudzus gadus ir satraukušas zinātnieku sabiedrību. Tās ir infekcijas slimības, kuras pārnēsā prioni jeb proteīnu daļiņas. Prioni visticamāk ir tīri proteīni – tie nesatur ne DNS, ne RNS. Taču infekciozajam aģentam obligāti jābūt pašreplicējošam. Kā tīrs proteīns var replicēt pats sevi?

Proteīns, kura agregācija bojā nervu šūnas šo slimību gadījumā, pastāvīgi tiek ražots organismā. Taču parasti tas salokās normāli, ir šķīstošs un tiek izvadīts no organisma bez problēmām. Taču, ja neliels daudzums šī proteīna salokās nepareizi, tas kļūst par skrāpija prionu. Ja šis prions saistās ar normālas salocīšanās starpformu, tas novirza salocīšanās procesu skrāpija prionu virzienā un, lai gan tam ir normāla aminoskābju sekvence, no tā izveidojas skrāpija prions. Un tā process turpinās: kamēr organisms turpina veidot normālu proteīnu, neliels daudzums skrāpija prionu var turpināt ražot arvien vairāk un vairāk jaunu prionu. Būtībā prions “replicē” pats sevi, un tam nav nepieciešamas nukleīnskābes.

Atšķirībā no amiloīdiskās neiropātijas, Alcheimera slimības un Kreicfelda – Jakoba sindroma, kur problēmas cēlonis ir toksiska, nešķīstoša amiloīda uzkrāšanās, daudzu cilvēka slimību cēlonis ir proteīnu nepareiza salocīšanās, kā rezultātā ir pārāk maz normāla proteīna, kas veiktu savu funkciju. Izplatītākā šāda veida iedzimtā slimība ir cistiskā fibroze.

Daudzu vēl nesen neskaidru šīs slimības simptomu cēlonis ir hlorīdjonu transportu caur šūnas membrānu regulējoša proteīna trūkums. Ir pierādīts, ka biežākā mutācija, kas ir pamatā cistiskajai fibrozei, traucē transportu regulējošā proteīna disociāciju no noteikta čaperona, tādēļ nevar notikt pēdējie normālas salocīšanās etapi, un netiek veidoti normāli šī proteīna daudzumi.

Iedzimtajai emfizēmas formai ir vēl lielāka analoģija ar mutāciju pētījumiem bakteriofāga P22 “astes” proteīnā. Pētnieki ir atklājuši, ka viena no tipiskākajām mutācijām, kas izraisa šo slimību, stipri palēnina salocīšanās procesu, līdzīgi kā to dara temperatūras atkarīgās mutācijas. Rezultātā notiek izveidoto salocīšanās starpsavienojumu uzkrāšanās un agregācija, tādēļ ar šo slimību slimajiem indivīdiem trūkst aktīva α – antitripsīna, kas aizsargātu to plaušas. Rezultātā attīstās emfizēma.

Pēdējo desmitgažu laikā ir noskaidrots, ka lielu daļu vēžu formu izraisa mutācijas gēnos, kas regulē šūnu augšanu un dalīšanos. Pazīstamākais no šiem gēniem, kas iesaistīts aptuveni 40 % no cilvēka vēža gadījumiem, ir gēns p53. Šī gēna kodētā proteīna funkcija ir pasargāt šūnas ar bojātu DNS no dalīšanās, pirms šis bojājums ir novērsts vai arī likt šīm šūnām noārdīties, ja bojājums nevar tikt novērsts. Citiem vārdiem, p53 pastāv, lai aizsargātu šūnas no kļūšanas par vēža šūnām.

P53 mutācijas, kas saistītas ar vēzi, var iedalīt divās klasēs. Pirmās neļauj proteīnam piesaistīties DNS, otras padara proteīna salocīto formu mazāk stabilu. Otrajā gadījumā vienkārši nekad nav pietiekams daudzums pareizi salocīta proteīna, kas bloķētu bojātā DNS replicēšanos.

Autors: Martina Baltkalne
mbaltkalne@yahoo.com
Izveidots: 08. 01. 2005.

Ievads

Izpēte

Ar nepareizu proteīnu salocīšanos saistītās slimības

Amiloīdiskā polineiropātija

Alcheimera slimība

Liellopu spongiozā encefalopātija

Citas slimības