Pastāvīgo preparātu pagatavošana augu anatomijā

LU Bioloģijas fakultāte
III kurss
Brigita Javoiša
2006

Saturs

Preparātu pagatavošanas vispārīgie principi

uz augšu
Auga daļu pastāvīgo preparātu pagatavošana ir sarežģītāka, ja salīdzina ar pagaidu preparātu gatavošanu, jo prasa daudz laika, lielāku rūpību utt. Atšķirībā no pagaidu preparātiem, pastāvīgos uzglabā ilgu laiku, griezumiem jābūt teicamas kvalitātes, tādēļ pastāvīgo preparātu gatavošanai izmanto ar mikrotomu grieztus griezumus (Kondratovičs 1976).

Augu materiāla ķīmiskā fiksācija

uz augšu
Ar ķīmisko fiksatoru palīdzību tiek fiksēti atsevišķi šūnas komponenti(piem., mitohondriji, kodoli, hromosomas), kas pastāvīgā preparāta sagatavošanas gaitā citādi netiktu saglabāti.

Ķīmisko fiksatoru shēmas un sastāvs ir ļoti daudzveidīgi, to izvēle ir paša pētnieka ziņā un atkarīga no konkrētā eksperimenta mērķiem. Biežāk izmantotais ir FAA fiksators (sastāvs : etanols, ledus etiķskābe, formalīns, destilēts ūdens). Tiek izmantoti arī FPA, Navašina, Karnua, Levicka fiksatori.

Fiksatoram jābūt svaigi gatavotam, tas nedrīkst būt silts. Fiksējamo materiālu jāsadala nelielos gabalos, lai tas ātrāk infiltrētos ar fiksatoru.

Fiksācijas laiks var būt ļoti atšķirīgs un ir atkarīgs no pētījuma mērķa – no 1 h līdz vairākām dienām.

 Parauga skalošana un atūdeņošana

uz augšu
Pēc fiksēšanas materiālu parasti skalo tekošā ūdenī (ja tas ir fiksators ūdens šķīdumā) vai spirtā (fiksators spirta šķīdumā). Šī procesa ilgums arī var būt dažāds – no 1 h līdz 48 h.

Tā kā cietinošā vide (piemēram, parafīns), kurā materiāls tiks ieslēgts pirms mikrotomēšanas, ir hidrofoba, tad audi ir pilnīgi jāatūdeņo (dehidrē), jo pretējā gadījumā parafīna infiltrācija audos nebūs iespējama un rezultātā var rasties pētāmo struktūru uzbūves artifakti.

Parasti atūdeņošanai izmanto etanolu.

Šeit jāpiebilst, ka lielākā daļa atūdeņošanas šķīdinātāju pēc savas ķīmiskās dabas nav tas pats, kas parafīna šķīdinātāji, tādējādi pēc dehidrēšanas vēl ieteicams iekļaut(ja līdzekļi to atļauj) starpposms, kad materiālu pārvieto no dehidrējošā šķīdinātāja parafīna šķīdinātājā (Ruzin 1999). Kā parafīna šķīdinātāji minami ksilols (plašāk pieejams), Histo-Clear TM,34, izopropanols, terc-butanols jeb TBA (dārgāki, ekskluzīvāki). Pēdējie divi tomēr ir salīdzinoši mazāk toksiski un vieglāk pielietojami (Ruzin 1999).

 Audu infiltrācija un ieslēgšana cietinošā vidē

Lai no augu materiāla varētu pagatavot plānus griezumus, tas jāieslēdz blīvā vidē (parafīns vai sintētiskie materiāli). Sākotnēji šīs vides ir šķidrā veidā, lai lēnā difūzijas ceļā iespiestos audos (tos infiltrētu) un pēc tam sacietētu.

Šajā posmā parafīna šķīdinātājs tiek aizvietots ar šķidru parafīnu (vai sintētisko materiālu). Ir ļoti svarīgi, lai infiltrācija noritētu pakāpeniski un pilnīgi – pretējā gadījumā nepilnīga šķīdinātāja nomaiņa ar parafīnu būs par iemeslu neveiksmēm mikrotomēšanas procesā (Ruzin 1999).

Bez tradicionālā parafīna tiek lietotas vēl arī citas, alternatīvas, cietinošās vides, kas gan ir salīdzinoši dārgākas un paredzētas sarežģītākiem eksperimentiem. Tās ir :  poliēstera vasks, karbovasks, celoidīns, metakrilāts, Paraplast ^RX-tra, Technovit sveķi u.c. No šadās vidēs cietinātiem audiem iespējams iegūt pat 0,5-3 mikrometrus biezu griezumu (Ruzin 1999).
Piemēram, "Technovit" cietinošie sveķi (alternatīva cietinošā vide) ir polimērs, kurš spēj stabilizēt audu struktūru tik stipri, ka iespējams iegūt pat 1 mikrometru biezu griezumu (Takechi et al., 1999).

Cietināšanu veic papīra kārbiņās vai speciālās metāla veidnītēs.

Materiāla infiltrācijai un sekojošai ieslēgšanai cietinošā vidē var tikt izmantotas speciālas mikroviļņu aparatūras (krāsnis), kas visu preparāta pagatavošanas laiku saīsina līdz pat 4 h (Schichnes et al 1999).

 Materiāla griešana

uz augšu
Cietinātie audi tiek griezti ar mikrotoma palīdzību. Ir divu veidu mikrotomi – slīdes un rotācijas, kas atšķiras ar to, ka slīdes mikrotomā bloks ar paraugu ir novietots stacionāri, kamēr mikrotoma nazis griež horizontālā plaknē, savukārt rotācijas mikrotomā stacionāri novietots ir nazis un pret tā malu tiek pārvietots bloks ar ieslēgto paraugu.

Slīdes mikrotomu izmanto, ja griežami lieli paraugi.

Iegūtos griezumus kārto uz priekšmetstikliem(tīriem!), iepriekš tos apstrādājot vai nu ar kādu speciālu līmvielu (adhezīvu) vai vienkārši ar olas baltuma un glicerīna šķīdumu (1:1).

Attēlā pa kreisi : slīdes mikrotoms Leica SM2500. Foto :
http://www.leica-microsystems.com/website/lms.nsf?opendatabase&path=/website/products.nsf/(ALLIDs)/DAA4E65F6EB18584C1256AEE003B456B

Attēlā pa labi : rotācijas mikrotoms Leica RM2245. Foto :
http://www.leica-microsystems.com/website/lms.nsf?opendatabase&path=/WebSite/products.nsf/(ALLIDs)/CC28848810E54B4F41256AB500530D5F

 Krāsošana

uz augšu
Parasti parafīns pirms krāsošanas tiek šķīdināts ar ksilolu.
Ir izstrādātas metodes, kad tradicionālo metodi vienkāršo, griezumus krāsojot bez parafīna noņemšanas (Xi et al. 1997).

Pēc parafīna izšķīdināšanas (deparafinēšanas) priekšmetstikli ar griezumiem tiek pārvietoti vispirms uz etanola:ksilola šķīdumu, pēc tam uz etanola šķīdumiem ar pakāpeniski samazinošos koncentrāciju (Ruzin 1999).

Krāsošanai parasti izmanto ūdens šķīduma krāsvielas.

Ir zināmas simtiem krāsošanas shēmu un metožu, un tās izvēlas atkarībā no izpētes mērķa. Krāsošanas metode var būt progresīva vai regresīva. Pēc progresīvās metodes preparātu krāso sākumā ar vājākas koncentrācijas krāsvielas šķīdumu, pārbaudot nokrāsošanās pakāpi mikroskopā. Tiklīdz šūnas struktūras sasniedz vajadzīgo krāsojumu, lieko krāsu noskalo (Kondratovičs 1976).

Pēc regresīvās metodes preparātus uzreiz krāso ar stipras koncentrācijas krāsvielu, bet pēc tam veic diferenciāciju, t.i., lieko krāsu izskalo ar šķīdinātāju, pārbaudot diferenciācijas pakāpi mikroskopā (Ruzin 1999).

Biežāk izmantotās krāsvielas augu anatomijā ir Safranīns (atkarībā no lignifikācijas pakāpes šūnapvalki krāsojas sarkanā līdz zilā krāsā), Anilīna zilais (sinonīmi : Jūras zilais, Katūna zilais – kallozes krāsošanai), Ātrais zaļais jeb Fast green (kā papildus krāsviela pēc Safranīna).

Krāsošanas procesa ilgums variē atkarībā no izvēlētās krāsošanas shēmas, parasti tās ir ~2-3 min.

Ir  aprakstītas metodes, kad tiek mēģināts vienkāršot tradicionālo parafinēšanas metodi, griezumus krāsojot vēl pirms parafīna  ekstrakcijas (deparafinēšanas) ar Toluidīna zilo krāsvielu (Xi et al. 1997).

Uzglabāšana

uz augšu
Lai iegūtos preparātus sagatavotu uzglabāšanai ilgākam laikam kā pastāvīgos preparātus, pēc krāsošanas tos atkārtoti ir jāatbrīvo no ūdens (dehidrē). To panāk, ūdeni saistītāju-vielu etilspirtu (pieaugošās koncentrācijās) pakāpeniski aizstājot vispirms ar etilspirta-ksilola šķīdumu, bet beigās ar tīru ksilolu.

Šādi sagatavotus priekšmetstiklus pārsedz ar segstikliņiem, kā cementējošo vielu izmantojot Kanādas balzamu ( kas nodrošina ilgstošu uzglabāšanu un nepieciešamās optiskās vides īpašības). Kā Kanādas balzama aizstājēji varētu tikt izmantoti arī Permount, Merkoglas (dārgi) u.c.

 Saulgriezes Helianthus annuus stumbra šķērsgriezums, pastāvīgais preparāts. Pagatavots pēc tradicionālās parafinēšanas metodes, griezums iegūts, izmantojot rotācijas mikrotomu Leica RM 2145 (Leica Microsystems GmbH), griezuma biezums 10 mikrometri.
Foto : B.Javoiša

Saulgriezes Helianthus annuus stumbra šķērsgriezums, pastāvīgais preparāts. Pagatavots pēc tradicionālās parafinēšanas metodes, griezums iegūts, izmantojot rotācijas mikrotomu Leica RM 2145 (Leica Microsystems GmbH), griezuma biezums 12 mikrometri.
Foto :  B.Javoiša