HBV (Hepatīta B vīruss)

Cilvēka hepatīta B vīruss (HBV) pieder Hepadnaviridae dzimtai. Līdzīgie vīrusi tika atrasti tādām dzīvnieku sugām, kā murkšķis (WHV) (Summers et al. 1978), zemes vāvere (GSHV) [13], pīle (DHBV) [14] un pelēkais gārnis (HHBV) [25].

Cilvēks ir vienīgais HBV nēsātājs, un vairāk nekā 350 miljoni cilvēku visā pasaulē ir inficēti ar B hepatīta vīrusu (seruma hepatīts), kurš nogalina vairāk nekā miljonu no tiem katru gadu. Inficēšanās var notikt caur asinīm vai kontaktā ar citiem organisma šķīdumiem (tādiem kā asaras, sviedri, siekalas, vaginālie izdalījumi utt.), pie ādas un gļotādas mikrotraumām [28].

HBV vairojas aknu šūnās (hepatocītos) un izsauc akūto un/vai hronisko aknu iekaisumu, kas var novest pie hepatocellulāras karcinomas izveidošanās.

Taksonomija

Pēc genoma uzbūves hepatīta B vīruss ir pieskaitāms pie retrovīrusiem. HBV tika atklāts 1965.g., un tas pieder pie 'Hepadnaviridae' (1. tipa Hepadna vīruss) vīrusu dzimtas [15].

Infekciozais virions (Deina daļiņa) ir DNS saturošais vīruss ar tropismu pret aknu šūnām. Vīrusa lipīd-proteīnu arējam apvalkam ir sfēriska forma 42 nm diametrā (skat. 3. att.). Apvalks sastāv no virsmas HBs antigēna (HBsAg) atkārtojošām struktūrām ar preS1 un preS2 antigēnu ārpusēji izvietotiem rajoniem. Apvalka iekšpusē atrodas kapsīds – vīrusa serde ar diametru 27 nm, kura sastāv no atkārtojošām proteīnu struktūrām - HBc antigēna (HBcAg). Kapsīdā iepakots genoma nukleoproteīna komplekss, virāla DNS-polimerāze un reversā transkriptāze. Daļēji denaturējot HBc antigēnu, izveidojas HBe antigēns, kuru tāpat var konstatēt saslimušo asins serumā. 

Hepatīta B viriona modelis

3. att. Hepatīta B viriona modelis [6].

http://www.sciencedaily.com/images/2006/06/060623093935.jpg

 

Ar HBV inficēto pacientu asinīs vīruss atrodams trīs veidu daļiņu formā:

1)      potenciāli infekciozas daļiņas 42 nm diametrā, pārklātas ar dubultapvalku – HBV virions, tā sauktās Deina daļiņas [2],

2)      sfēriskas daļiņas 20 nm diametrā,

3)      dažāda garuma filamenti apmēram 20 nm diametrā.

Otrā un trešā veida daļiņas atrodas asins serumā lielā daudzumā, tas nesatur vīrusa DNS un tāpēc nav infekciozas. Šādas daļiņas veidojas no HBs antigēna ar nelielu preS2 antigēna klātbūtni.

Genoms

HBV genoms ir 3,2 nukleotīdu pāru garš, un to veido gredzenveida DNS ar daļēji dubultķēžu struktūru. Garā “mīnuss”ķēde satur visus vīrusa dzīves ciklam nepieciešamus gēnus, īsā “plus” ķēde variē pēc garuma un sastāda 50 - 80% no “mīnuss”ķēdes garuma. Genoma gredzenveida struktūra veidojas pateicoties divu ķēžu komplementāro nukleotīdu bāžu sapārošanai tā sauktajos “lipīgajos” 5’-galos. “Mīnuss” ķēde 5’-galā kovalenti saistīta ar nukleokompleksa proteīna molekulu, bet “plus” ķēdes 5’-galā pievienots īss RNS oligonukleotīds [26].

HBV genomā ir četri atklāti nolasīšanas rāmji, nosaukti pēc atbilstošiem daļēji pārklājošiem gēniem: S, C, P un X. Šie gēni satur ne tikai strukturālas, bet arī regulatoras secības, kas pārvalda vīrusa proteīnu sintēzi un replikācijas ciklu.

 S gēns kodē viriona apvalka triju klašu proteīnus, kuri tiek translēti no trim dažādiem iniciācijas kodoniem: LHBs (lielais HBs antigēns) no pirmā, MHBs (vidējais HBs antigēns) no otrā un SHBs (mazais HBs antigēns) no trešā AUG kodona. LHBs satur preS1, preS2 un S kodētās aminoskābju secības un ir 400 as (adw subtipam) vai 389 as (ayw subtipam) garš. MHBs tiek veidots no preS2 (55 as) un S (226 as) kopīgas translācijas. Apvalka proteīns SHBs ir 226 as garš.

C gēns kodē HBc un HBe antigēnu aminoskābju secības. [1].

P gēns kodē visgarāko aminoskābju secību – 832 as atlikumus – tajā skaitā HBV specifiskas DNS-polimerāzes aminoskābju secību.

X gēna iekodētiem polipeptīdiem piemīt regulatora īpašības, tie transaktivē vīrusa gēnu ekspresiju. Šī gēna produktiem vēl nav līdz galam noskaidrotas funkcijas.

HBV replikācija notiek tikai hepatocītos. Pēc iekļūšanas šūnā un atbrīvošanās no ārējā apvalka viriona daļiņa nonāk kodolā, kur notiek “pluss” ķēdes pagarināšanās un cirkulāra genoma reparācija. Šo procesu nodrošina vīrusa polimerāzes proteīna DNS-atkarīgās DNS-polimerāzes aktivitāte. Saimniekšūnas DNS-atkarīgā RNS-polimerāze sintezē uz DNS pavediena pilna genoma RNS kopiju – pregenomu – 3,4 kb garu mRNS molekulu. Kodolā notiek arī īsāko mRNS transkripcija, tie satur informāciju par viriona daļiņai nepieciešamo proteīnu uzbūvi. Pregenoms un vīrusa DNS-polimerāze tiek transportēti uz šūnas citoplazmu, kur notiek reversā transkripcija ar tam sekojošo pregenoma noārdīšanu. Vīrusa DNS, DNS-polimerāze un reversā transkriptāze tiek iepakotas core kapsīdā un tālāk virsmas proteīnu apvalkā [27].

HBV replikācija hepatocītā un viriona izkļūšana no šūnas neizsauc šūnas sagraušanu vai funkcionēšanas pārtraukšanu. Hepatocītu citolīzi un ar to saistīto aknu nekrozi akūtas HBV infekcijas gadījumā izraisa galvenokārt pretvīrusa imunitātes efektorie šūnu un šūnu - humorālie reakciju mehānismi.

HBcAg struktūra, sastāvdaļas un raksturīgākās īpašības

HBV genoma atklātās nolasīšanas rāmis C satur divus translāciju iniciējošus kodonus ATG un to produkti ir četri dažādi polipeptīdi: p25, p22, p21 un p17.

Polipeptīda p25 translācija sākas no pirmā ATG kodona. Tālāk p25 tiek modificēts sekojoši: no N-gala tiek nošķeltas nost 19 preC aminoskābes un izveidojas p22 polipeptīds, kas savukārt, pie C-gala procesinga rezultātā pārveidojas p17 polipeptīdā. p17 vai e-proteīns tiek sekretēts no inficētās šūnas kā HBe antigēns. HBe antigēna funkcija nav zināma, ir noskaidrots, ka, tas nav nepieciešams vīrusa dzīves ciklā vai infekcijā, kaut arī tas var kalpot, ka imūnomodulējošais faktors [23].

4. att. C gēna kodēti proteīni.

Figure 4. Proteins encoded by C gene.

 

HBc antigēns vai p21 tiek sintezēts no otra iniciācijas kodona un ir HBV nukleokapsīda strukturāla vienība. Bez strukturālās funkcijas p21 piedalās vīrusa replikācijas ciklā: RNS iepakošanā, DNS sintēzē, viriona nobriešanā, vīrusa apvalka proteīnu atpazīšanā, viriona izkļūšanā no šūnas un tā procesu regulācijā.

Elektronkriomikroskopija atklāja HBc daļiņas trīsdimensionālas struktūras īpatnību – galvenokārt α-spiralisko organizāciju, kas atšķiras no citu vīrusu kapsīda proteīniem. Monomēru divu α-spirāļu smaile dimēros veido saini no četrām α-spirālēm, kas izceļas virs HBc daļiņas virsmas. Smailes gala centrālajā pozīcijā as 74-89 atrodas MIR (galvenais imūnodominantais rajons) [22].

Aminoskābju delēcijas starp as Gly73 un Gly94 neietekmē HBc daļiņas spēju pašsavākties, bet samazina HBcAg imunogenitāti.

HBcAg molekulas veido divu veidu daļiņas – lielas un mazas – kuras sastāv no attiecīgi 240 un 180 monomēriem katra. Lielām daļiņām ar triangulācijas skaitli T=4 un diametru 34nm ir 120 izceļošo smaiļu, bet mazām ar T=3 un 30 nm diametrā - 90 smaiļu [5].

C-terminālās α-spirāles galā atrodas rajons (as 127-133), kas veido nelielu izcilni uz HBc daļiņas virsmas.

Pierādīts, ka p21 C-termināla arginīnu saturoša rajona (as 150-183) trūkums neiespaido HBcAg proteīna pašsavākšanas spējas un tā saukto HBcΔ daļiņu (C-gala saīsināta HBcAg) veidošanu. Kā parādīja elektronkriomikroskopija, C-gala saīsinātie polipeptīdi veido HBcΔ daļiņas, kuras gandrīz nav atšķiramas no pilna garuma HBc daļiņām. Pierādīts, ka HBcΔ daļiņas ir mazāk stabilas, nespēj saistīt RNS un uzkrājas kā tukšie apvalki [4]. HBcΔ daļiņu pašsavākšanās spēju ierobežo C-gala rajons ap 140 aminoskābju atlikumu. C-gala rajons 140-149 as nosaka HBcΔ daļiņu T=3/ T=4 izoformu procentuālo attiecību [30].

Neskatoties uz to, ka HBcAg ir iekšējais viriona komponents, tam piemīt ļoti augsta imunogenitāte – anti-HBc antivielu augstie titri ir sastopami praktiski visiem HBV inficētiem pacientiem. Anti-HBc antivielas nav vīrusa neitralizējošas, un to konstatēšana, kā arī HBe antigēna parādīšanās asinīs, liecina par vīrusa aktīvo replikāciju.  Akūta B hepatīta gaitā anti-HBc antivielas parādās agri un samazinās ar lēni dilstošiem titriem gadiem ilgi.

HBc Ag imunoloģiskās īpašības

Neskatoties uz to, ka HBcAg ir HBV iekšējais komponents, augsti anti-HBc antivielu titri veidojas visiem ar HBV inficētiem pacientiem. Anti-HBe antivielas veidojas daudz vēlāk pēc anti-HBc antivielu parādīšanas vai neveidojas vispār. Iespējams, ka HBeAg inducē imūnoloģisko toleranci bērniem piedzimušiem no HBV pozitīvām mātēm, tādā veidā palielinot hronisko nēsātāju skaitu [17].

HBcAg piemīt augsta imunogenitātes spēja: anti-HBc antivielu produkcija ir 80 reizes lielāka nekā anti-HBs-antivielu produkcija. Starp visiem HBV polipeptīdiem HBcAg inducē visspēcīgāko B-šūnu, T-šūnu un CTL atbildi. Lai dzīvniekiem zinātniskos nolūkos izsauktu efektīvu anti-HBc antivielu produkciju, ievadot organismā HBcAg nav nepieciešami nekādi papildus adjuvanti un palielinot HBcAg devu tiek sasniegts augstāks anti-HBc antivielu titrs [16].

Ar HBV inficētiem pacientiem veidojas specifiska T-šūnu imūnā atbilde: vīrusa eliminācija atbilst Th-šūnu aktivitātes līmenim. HBcAg un HBeAg specifiskās T-šūnām ir svarīga loma hroniska hepatīta B kontrolē un HBeAg izdalīšanās gaitai asinīs.

HBcAg izsauc spēcīgu CTL atbildi. HBV specifiskie CTL ietekmē vīrusa replikāciju, sagraujot inficētās šūnas un var veidot imunosupresiju. CTL atpazīst HBcAg molekulas rajonu as 11 - 27 [3] un as 141 - 151.

HBcAg galvenais imunodominantais B-šūnu epitops (c1) atrodas molekulas vidū aminoskābes rajonā 74-83, divi HBeAg imunodominantie epitopi lokalizējas as 76-89 (e1) un as 129-140 (e2) pozīcijās [22]. Tādēļ rajons as 74 - 89 nosaukts par HBc molekulas galveno imūnodominanto rajonu (MIR) [4]. c1 epitops ir konformacionāls epitops, kurš ir eksponēts uz HBc daļiņas virsmas [7]. Šim rajonam piemīt hidrofīlās īpašības un tam ir augsts antigenitātes indekss [12].

T-šūnu epitopi pārklāj gandrīz visu HBcAg molekulu, izņemot rajonu as 77-82. T-šūnu atpazīšanas secības HBcAg molekulā tika noskaidrotas ar 12 līdz 21 aminoskābju atlikumu garu sintētisku peptīdu palīdzību. Izrādās, ka, piemēram, dažādu līniju peles spēj atpazīt dažādus T-šūnu epitopus, bet katrai līnijai ir viena galvenā T-šūnu determinante. Šī atpazīšanas procesa specifiskums atkarīgs no peļu līnijas H-2 haplotipa. Piemēram, H-2b haplotipa līnijas peles atpazīst rajonu as 129-140, bet H-2d – as 85-100. Pastāv hipotēze, ka cilvēku populācijā indivīdi arī var atšķirties T-šūnu epitopu atpazīšanā atkarībā no sava cilvēka leikocītu antigēna (HLA) genotipa.

HBcAg piemīt gan T-atkarīga, gan T-neatkarīga antigēna īpašības. T-atkarīgie antigēni tiek prezentēti uz antigēnprezentējošo šūnu membrānas kompleksā ar MHC II klases molekulām. Tur tie tiek atpazīti ar antigēna specifiskām Th-šūnām, kuri savukārt tālāk aktivē B-šūnas. T-atkarīgie antigēni pie atkārtotas ievadīšanas izsauc IgG izotipu produkciju un antivielu afinitātes paaugstināšanos, kas inducē humoralo atmiņu. T-neatkarīgie antigēni aktivē B-šūnas bez T-šūnu līdzdalības un izsauc galvenokārt IgM antivielu produkciju (arī pie atkārtotas ievadīšanas), neveidojot B-šūnu atmiņu. HBcAg inducēja IgM un IgG antivielu produkciju beztīmusa (Nu/Nu) B10.BR un Balb/c pelēm neskatoties uz T-šūnu trūkumu. Tīmusa pelēs HBcAg efektīvi stimulēja T-šūnu proliferāciju in vitro un Th-šūnu funkcijas in vivo [18].

HBV Core daļiņas - svešu epitopu nesēji

HBcAg, ka svešu epitopu nesēja praktiskā pielietošana ir iespējama pateicoties tā augsta līmeņa sintēzei un spējai pareizi pašsavākties dažādās ekspresijas sistēmās. Ievietojot svešu epitopu HBcAg molekulā himērā daļiņa spēj nodrošināt tām augstas pakāpes B- un T-šūnu imūnogenitāti.

HBc daļiņas tika pirmo reizi apskatītas kā daudzsološas vīrusiem līdzīgo daļiņu (VLD) nesējas 1986.g., bet par tām tika paziņots 1987.g. [20]. Esot par vienām no pirmajām VLD kandidātēm un VLD nesējām, HBc daļiņas kļuva par viselastīgāko un visdaudzsološāko, pārzinātāko paraugu svešā (foreign) peptīda sekvencēm līdz pat šim laikam. HBc daļiņu, kas kalpo par VLD nesējām, izmantošanas iespējas tiek diezgan plaši pētītas.

Insercijas N-galā

N-galā ievietoto svešo epitopu secību maksimālais garums sasniedz 50 aminoskābes. Pieradīts, ka šie epitopi atrodas daļiņas virspusē un tos var atpazīt specifiskās antivielas.

Lai gan N-galā insertēts epitops tiek samērā labi prezentēts uz nesēja (HBcAg) virsmas, inserta garums ir ierobežots, jo tiek ietekmēta kapsīda savākšanās spēja.

Insercijas C-galā

Insertu lielums C-galā var pārsniegt 100 aminoskābes. Visbiežāk tiek izmantotas insercijas aiz 144., 149. un 156. aminoskābes, kā arī pašā galā. Arī izmantotie vektori var būt gan pilna garuma HBcAg, gan HBcΔ, turklāt inserti C-galā var izsaukt stabilizējošu efektu uz HBcΔ rekombinantiem. Lai gan insertētās sekvences tiek vismaz daļēji prezentētas uz nesēja virsmas, antivielu veidošana pret tām ir samērā vāja.

Gan C-, gan N-gala insercijas saglabā neskartu HBcAg imunogenitāti, jo MIR (Major Immunodominant Region) paliek neskarts.

MIR insercijas

MIR jeb mažorais imunodominantais rajons atrodas HBc kapsīda smailē un izsauc gan humorālo, gan šūnu imunitāti. Šobrīd MIR ir atzīta kā laba insercijas vieta, jo epitops tiek labi prezentēts uz nesēja virsmas, bez tam tajā var ievadīt samērā lielas un pat vairākas insercijas. Lai rekombinantā HBc kapsīdā paaugstinātu inserta imunogenitāti, ar delēcijām ir jāiznīcina paša HBcAg imunogēnie epitopi.

Rekombinanti HBc ar MIR insertiem var tikt izmantoti ne tikai kā epitopu nesēji, bet arī kā šūnu receptoru un ligandu aizstājēji [21].

Svešu aminoskābju secību ievietošanai visbiežāk pielieto sekojošas HBcAg pozīcijas as 144, 149 un 156. Atkarībā no ievietotas aminoskābju secības struktūras, to garums var pārsniegt 100 as. C-gala insercijām izmanto divu veida vektorus: HBcΔ un pilna garuma HBc antigēnu. Atšķirībā no natīvām HBc daļiņām, uz HBcΔ bāzes veidotie kapsīdi ir mazāk stabili. Ievietojot HBc daļiņā svešu aminoskābju secību tās pat var stabilizēt HBcΔ daļiņas. Svarīgi, ka N- un C- galā ievietotie svešie epitopi ir imunogēni, himērās daļiņas saglabā pietiekoši augstu paša HBcAg imunogenitāti.

Svešo epitopu insercijas MIR rajonā (as 74-89) garantē tiem augstas pakāpes B- un T-šūnu imūnogenitāti. Neskatoties uz MIR centrālo izvietojumu HBc molekulā te iespējams ievietot 238 aminoskābju garu secību [11]. Ļoti svarīgi, ka delēcijas MIR rajonā samazina paša HBcAg un tajā pašā laikā dod iespēju paaugstināt ievietotas secības imunogenitāti.

Guntars, lapa pēdējo reizi labota 22-01-2008 09:33