1 6 pilda ar kapsīdus saturošiem paraugiem pa 10 20 µl.
AV pilda ar antivielām, 10 20 µl.
Ja nepieciešams, kādā no bedrītēm var iepildīt kontroles antigēnu.
1. Dzesējot ledus vannā, rekombinanto DNS saturošam maisījumam pievieno 50 - 100 ml kompetento E.coli šūnu.
2. Stobriņu 10 - 20 min inkubē ledus vannā.
3. Tad šūnas pakļauj temperatūras šokam: 2 min 42oC (ar slāpekļa metodi pagatavotās kompetentās šūnas +42°C tur 35 sek., ar PEG metodi 2 min).
4. Pēc šoka šūnas atkal ievieto ledus vannā un pievieno tām 0,9 1 ml LB barotnes bez ampicilīna.
5. Šūnas audzē tajos pašos stobriņos, kratot vienu stundu pie +37oC.
6. Tad transformācijas maisījumu pa 50 - 200 ml izkliedē uz selektīvas agorizētas barotnes- Petri platēm ar ampicilīnu.
7. Plates apgriež otrādi un inkubē pa nakti 16 24h termostatā pie 37oC.
Polimerāzes ķēdes reakciju (Polymerase chain reaction - PCR) ļoti plaši izmanto visdažādākajās bioloģijas un medicīnas nozarēs, kā arī diagnostikā, DNS fragmentu pavairošanai, mutaģenēzē un sekvenēšanai. Ar PCR palīdzību no maza DNS daudzuma (dažām molekulām) iespējams iegūt vairākus mikrogramus DNS.
Metodes būtībā ir DNS amplifikācija, ko veic termostabila polimerāze (Taq polimerāze). PCR balstās uz 20 - 40 reižu atkārtotiem DNS sintēzes cikliem. Ar katru nākamo ciklu DNS daudzums pieaug divas reizes. Katru sintēzes ciklu veido trīs reakcijas posmi: DNS denaturācija, praimeru hibridizācija un DNS sintēze.
1) DNS denaturācija
Lai reakcijā izmantojamiem oligonuklotīdiem padarītu pieejamas DNS mērķsekvences, nepieciešams veikt DNS komplementāro ķēžu atdalīšanu, kas iespējama, paaugstinot temperatūru līdz 94oC. Šādā temperatūrā noārdās ūdeņraža saites starp slāpekļa bāzēm DNS molekulā un pavedieni atdalās.
2) Praimeru hibridizācija
Pēc denaturācijas DNS atrodas vienpavediena stāvoklī. Lai DNS polimerāze varētu uzsākt DNS sintēzi, nepieciešams, lai praimeri, piesaistītos komplementārajiem DNS rajoniem. Lai oligonukleotīds varētu hibridizēties ar matricas DNS, vides temperatūra jāpazemina līdz 40 70oC (hibridizācijas temperatūra atkarīga no nukleotīdu sastāva un garuma praimerī; praimeriem, kas ir līdz 20 nukleotīdiem gari, to var aprēķināt pēc formulas: t = 4*(G+C)+2*(A+T)).
3) DNS sintēze (elongācija)
Hibridizēšanas rezultātā radies praimeru un matricas DNS komplekss, kas ļauj Taq polimerāzei uzsākt DNS sintēzi. Šim procesam nepieciešama 72oC temperatūra. DNS sintēzes ātrums Taq polimerāzei var būt 35 100 nukleotīdi/sekundē atkarībā no matricas DNS struktūras, reakcijā izmantotā bufera, sāļu koncentrācijas vidē un vides pH.
Master mix vienam paraugam:
|
Daudzums |
PCR |
|
72 μl 10 μl 10 μl 2 μl 2 μl 1 μl 1 μl |
DEPC treated Water, 10x PCR Buferis (Buff. Taq MgCl2), MgCl2 (25 mM MgCl2), dNTP (10 mM dNTP Mix), praimeri (20 pM), Taq /DNS Polimerāze (5 u/μl), DNS |
|
100 μl |
Kopā: |
PCR reakcijas apstākļi:
Reakciju veic programmējamā amplifikātorā (termostatā). Reakcijas galaproduktu uzglabā pie +4oC, ilgstoši uzglabā pie -20oC.
Restrikciju ar restrikcijas endonukleāzēm izmanto ieklonēta fragmenta orientācijas noteikšanai, klonēšanai, klonu selekcijai, vektora veidošanai.
Viena restrikcijas endonukleāzes aktivitātes vienība (1u) sašķeļ 1 mg DNS 1h laikā optimālos apstākļos. Parasti ņem 1,5 - 3 vienības uz 1 mg DNS. 1 mg DNS šķeļ tā, lai kopējais reakcijas maisījuma tilpums būtu 10 ml. Reakciju veic vienā no buferiem ("MBI Fermentas"), kurš ir attiecīgajam fermentam vispiemērotākais.
Optimālā reakcijas toC norādīta katram fermentam ( parasti tā ir +37oC). Pēc 1 - 2h 10 ml parauga uznes uz agarozes gēla kopā ar molekulmasas marķieri un pārbauda restrikcijas efektivitāti.
Restrikcijas maisījums:
- 1 ml 10x inkubēšanas bufera;
- 1 ml DNS;
- 0.3 ml fermenta (10 u/ml);
- 7.7 ml d.H2O.
Agarozes gēla elektroforēze ir standarta metode DNS fragmentu attīrīšanai, identifikācijai un sadalīšanai. Elektroforēze ir vielu maisījuma sadalīšanas metode, kas pamatojas uz jonu kustīgumu elektriskajā laukā un DNS fragmenti tiek sadalīti pēc garuma. Tā kā DNS ir negatīvi lādēta, tā elektriskajā laukā kustas no negatīvā elektroda uz pozitīvo. Ar šo vienkāršo metodi var ātri sadalīt tādus DNS fragmentu maisījumus, kurus nav iespējams sadalīt citā veidā, piemēram, ar centrifugēšanu blīvuma gradientā. Darbā izmantots 1% agarozes gēls, ko pagatavo, 100 ml bufera pievienojot 1g agarozes.
Procesam iespējams sekot, ja DNS tiek krāsota ar interkelējošu krāsu - etīdija bromīdu (kancerogēna viela - tādēļ pievienošanas laikā un saskarē ar gēlu vienmēr uzvilkt cimdus). Etīdija bromīdu lieto zemā koncentrācijā - uz 100 ml agarozes pievieno 15 ml etīdija bromīda ar konc. 10 mg/ml. Apskatot gēlu ultravioletajā apgaismojumā, var pamanīt pat 1 ng DNS. Apskatot gēlu UV gaismā obligāti jāizmanto aizsargmaska, lai neiegūtu acu gļotādas un ādas apdegumus.
Elektroforēzē parasti izmanto buferus, kas satur tris-acetātu, tris-borātu vai tris-fosfātu 50 mM koncentrācijā ar pH 7.5-7.8. Savā darbā izmantoju visus trīs iepriekš pieminētos buferus, ko lieto arī agarozes gēlu pagatavošanai.
|
50x TAE buferis |
10x TBE buferis |
|
· 242 g Tris; · 57.1 ml ledus etiķskābes; · 100 ml 0.5M EDTA; · pH 8.0. |
· 108 g Tris; · 55 g borskābes; · 40 ml 0.5 EDTA; · d.H2O līdz 1l. |
Lai varētu sekot elektroforēzes gaitai, izmanto divas krāsas (bromfenolzilo un ksilēncianolu), kas norāda, cik tālu ir aizgājis noteikta garuma fragments (krāsu sastāvā esošais glicerīns palielina parauga blīvumu, tādēļ tas neizskalojas no gēla bedrītes). 2% agaroze kcilēncanola kustība atbilst 750 bp dsDNS fragmentam, bet bromfenola - 250 bp.
Uznesot DNS paraugus uz gēla, uznes arī attiecīgo marķieri, lai varētu identificēt vajadzīgo joslu. Savā darbā izmantoju 100 bp (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, MBI Fermentas) un 1 kb garuma marķieri (GeneRulerTM 1 kp DNA Ladder, MBI Fermentas, Lietuva).
TAE agarozes gēlu elektroforēzi veic pie 290 mV un 170 mA.
TBE agarozes gēlu elektroforēzi veic pie 290 mV un 120 mA strāvas stipruma.
Un elektroforēzes rezultātus apskatās transiluminatorā ultravioletajā starojumā un nepieciešamības gadījumā nofotografē.
Gēla maksimālais svars, kuru var apstrādāt pēc šī te protokola, ir 300 mg; kolonna spēj pielāgot 600 μl lielu maksimālo apjomu (t.i., 300 mg gabaliņš gēla un 300 μl saistīšanās bufera (Capture buffer)).
1. Nosver tukšu 1,5 ml mikrocentrifūgas stobriņu (~ 10 mg) un atzīmē tā svaru.
2. Izmantojot tīru lāpstiņu vai skalpeli, izgriež gabalu agarozē saturošo DNS joslu attīrīšanai. Griež tik tuvu DNS joslai, cik iespējams. Sagriež gabaliņu atsevišķās nelielās daļās un pārvieto tos uz jau nosvērto 1,5 ml mikrocentrifūgas stobriņu.
3. Nosver stobriņu kopā ar saturošo agarozes gabalu (~ 10 mg) un atņem tukšā stobriņa svaru, lai noteiktu gabaliņa svaru.
4. Gēla gabalam pieliek 10 μl saistīšanās bufera uz katriem 10 mg gēla (maksimālais kolonnas tilpums ir: 300 μl saistīšanās bufera + 300 mg gēla).
5. Aiztaisa stobriņu un samaisa, vorteksējot enerģiski. Inkubē pie 60oC līdz agaroze ir pavisam izšķīdusi (5 15 min).
6. Inkubācijas perioda laikā ievieto vienu GFX kolonnu (GFX column) uzkrājošajā stobriņā (Collection tube) katrai attīrīšanai, kas tiks veikta.
7. Pēc tam, kad agaroze ir pavisam izšķīdusi, centrifugē īsi, lai savāktu paraugu stobriņa apakšā.
8. Pārvieto paraudziņu GFX kolonnā. Inkubē istabas temperatūrā 1 min.
9. Centrifugē mikrocentrifūgā pie pilna ātruma 30 sek.
10. Atbrīvojās no caurplūsmas šķidruma, iztukšojot uzkrājošo stobriņu. Novieto GFX kolonnu atpakaļ uzkrājošā stobriņa iekšpusē.
11. Kolonnai pievieno 500 μl mazgāšanas bufera. Centrifugē pie pilna ātruma 30 sek.
12. Atbrīvojas no uzkrājošā st. un pārvieto GFX kolonnu svaigā 1,5 ml mikrocentrifūgas stobriņā (t.s., nevis uzkrājošajā stobriņā).
13. Lieto 50 μl izskalošanas buferi (Elution buffer) (10 mM Tris-HCL pH 8.0) vai autoklāvētu dubult-destilētu ūdeni (taisni uz stikla šķiedras matricas augšā GFX kolonnā).
Lai izmazgātu DNS daudz koncentrētākā veidā, samazina izskalošanas apjomu ne mazāk par 10 μl.
Piezīme: Lietojot zemus izskalošanās lielumus koncentrātam, DNS paraugs samazināsies, lai atgūtu zaudēto.
14. Inkubē paraugu istabas temperatūrā 1 min.
15. Centrifugē pie pilna ātruma 1 min, lai atgūtu attīrīto DNS.
Piezīme: Pie 50 μl izskalošanas faktiskais parauga atgūtais daudzums svārstīsies no 40 līdz 50 μl. Pie 100 μl izskalošanas atgūtais daudzums svārstīsies no 5 līdz 7 μl.
DNS ekstrakcija iekļauj izmainītu Fogelšteina un Gilespi (Vogelstein & Gillespie) DNS ekstrakcijas protokolu, kurā tiek izmantotas stikla mikrodaļiņas.
DNS izdalīšanas komplektu izmanto:
· DNS ekstrahēšanai no visiem agarozes tipiem (nav piemērots attīrīšanai no akrilamīda gēla);
· DNS koncentrēšanai;
· Lai atbrīvotu DNS paraugu no polimerāzes ķēdes reakcijas laikā neizmantotajiem nukleotīdiem, praimeriem, praimeru dimēriem un proteīniem;
· Lai attīrītu DNS no etīdija bromīda, hloroforma un fenola.
Nātrija jodīda klātbūtnē DNS pie paaugstinātas temperatūras tiek adsorbēta, notiek agarozes polisaharīdu ķēžu degradācija un DNS paliek šķīdumā. DNS absorbējas uz speciāli pagatavotām stikla pulvera mikrodaļiņām. Stikla daļiņas, kas satur absorbētu DNS, tiek mazgātas, lai atbrīvotos no NaJ un piemaisījumiem no analizējamā parauga. Tad, suspendējot stikla pulveri ūdenī, DNS tiek eluēta.
DNS ekstrakcijas metodi var lietot dažāda garuma un izmēra DNS izdalīšanai.
Metodes efektivitāte ir >80%. Ir iespējam izdalīt pat 120 bp mazu DNS fragmentu.
Proteīni stikla pulverim pievienoties nespēj un tiek aizskaloti mazgāšanas procesā.
Attīrītā DNS ir ērta lietošanai tālākos molekulārās bioloģijas eksperimentos: klonēšanā, sekvencēšanā, restrikcijā u.c.
Protokols:
1. Uznes DNS saturošu šķīdumu uz agarozes gēla (2% TBE) un sadala reakcijas produktus elektroforēzē. Izgriež agarozes gēla joslu, kas satur vajadzīgo DNS fragmentu. Nosaka aptuveno gēla gabaliņa tilpumu (1g atbilst apmēram 1 ml) un ievieto to ependorfā.
2. Pievieno 3 tilpumus NaJ šķīduma. Inkubē 5 min pie 55oC, lai izšķīdinātu agarozi.
Ekstraģējot DNS no TBE agarozes gēliem, pievieno 0.5 tilpuma TBE konvertējoša bufera un 4.5 tilpumus NaJ šķīduma.
3. Pievieno resuspendētu stikla pulveri. Atkarībā no DNS koncentrācijas pievieno 2 5 ml suspensijas (1 mg DNS - 2 ml suspensijas) un inkubē 5 min pie 55oC.
4. Nocentrifugē stikla pulvera un DNS kompleksu 5 sek. - 1 min. Atdala supernatantu un saglabā to (beigās elektroforēzē pārbauda vai šķīdumā nav palikusi DNS).
5. Nogulsnes trīs reizes mazgā ar 500 ml ledus aukstā mazgāšanas bufera (satur 70o etanolu), katru mazgāšanas reizi nogulsnes homogēni resuspendējot. Pēc trešās mazgāšanas reizes stobriņu nocentrifugē un pilnīgi aizvāc visu šķidrumu.
6. Nogulsnes 10 - 15 min žāvē vakuumā.
7. DNS eluē ar ūdeni. Nogulsnes resuspendē divos tilpumos ūdens (attiecībā uz pievienotā stikla suspensijas daudzumu). Stobriņu inkubē 5 min pie 55oC. 30 sek. cenrifugē un uzmanīgi atdala supernatantu, kas satur DNS. Eluēšanas procedūru atkārto.
8. Iegūtos paraugus analizē agarozes gēla elektroforēzē.
Reakciju veic T4 fāga DNS ligāze, kas katalizē fosfodiestersaites veidošanos starp blakusesošām DNS 3“-OH un 5“-fosfātgrupām. Fermenta aktivitātei nepieciešami magnija joni. T4 fāga DNS ligāzi lieto ar lipīgiem komplementāriem galiem DNS molekulas sašūšanai, kā arī DNS fragmentu strupo galu sašūšanai savā starpā vai sintētisko linkeru piešūšanai.
Reakcijas maisījums, 10 ml:
|
5 ml 1 ml 1 ml 2 ml 1 ml |
- d.H2O, - 10x ligēšanas buferis, - vektors (100 ng), - fragments (100 ng), - T4 DNS-Ligāze (5 u/ml). |
Metodē iekļauts etaps DNS attīrīšanai no RNS ar RNāzi, kā arī DNS deproteinizācija ar hloroformu.
1. Izaudzētās šūnas pa 1,5 ml salej ependorfa stobriņos un centrifugē pie 10000 apgr./min 5 minūtes.
2. Šūnas resuspendē 200 ml šķīduma I (šķīdums satur RNāzi), stobriņu saturu vorteksē.
3. Pievieno 200 ml šķīduma II, sakrata (vorteksēt nedrīkst, jo tas noved pie DNS molekulu degradācijas).
4. Pievieno 200 ml šķīduma III, sakrata. Centrifugē 20 min pie 10000 apgr./min, supernatantu pārnes citā stobriņā.
5. Supernatantam pievieno 0.6 tilpumus (420 ml) izopropanola, stobriņu saturu sakrata, centrifugē 20 min pie 10000 apgr./min.
6. Nogulsnes mazgā ar 70% etanolu, centrifugē 5 min pie 10000 apgr./min, supernatantu nolej.
7. Nogulsnes žāvē vakuumā (~10 min ) un izšķīdina 20 ml d.H2O vai TE buferī (DNS koncentrācija ~1 mg/ml).
Ja tālākam darbam nepieciešama labi attīrīta DNS, tad veic paraugu deproteinizāciju.
|
Šķīdums I |
Šķīdums II |
Šķīdums III |
|
- 100 mM tris-HCl, pH = 7.5, - 10 mM EDTA, - 400 mg/ml RNāze, vāra 10 min. |
- 0.2M NaOH, - 1% SDS. |
- 3M kālija acetāts, - 5M etiķskābe. |
DNS sekvenēšana ir viena no svarīgākajām molekulārās bioloģijas metodēm.
Šī sekvenēšanas metode balstās uz fluorescento iezīmju izmantošanu. Reakcijas veikšanai izmanto jau gatavu maisījumu - Big DyeTM, kurā ietilpst krāsu terminatori didezoksinukleotīdu trifosfāti (dNTP), kas iezīmēti ar augstas jutības krāsām, AmpliTaq DNS polimerāze, magnija hlorīds un buferis.
Big Dye® maisījums:
- A- krāsas terminators (zaļš)
- C- krāsas terminators (zils)
- G- krāsas terminators (melns)
- T- krāsas terminators (sarkans)
- Dezoksinukleozīdu fosfāti (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
- AmpliTaq DNS polimerāze, FS;
- MgCl2;
- Tris- HCl buferis, pH 9.0.
Reakcijas sagatavošana 1 paraugam (20ml):
|
13 μl 3 μl 1 μl 2 μl 1 μl |
d.H2O, 5x sekvenēšanas buferis, praimers (3.2 pM), Big Dye maisījums, DNS (100-250ng). |
Stobriņu saturu viegli samaisa un nocentrifugē.
PCR reakcijas programma:
10 sek. pie 96oC;
5 sek. pie 50oC;
4 min pie 60oC.
Ciklu atkārto 25 reizes. Pēc reakcijas stobriņus ievieto pie +4oC līdz to attīrīšanai.
1. Mazajiem stobriņiem ar PCR reakcijas maisījumu pievieno 16 ml d.H2O un pēc tam arī 64ml 95% aukstā etanola.
2. Vorteksē.
3. Inkubē istabas temperatūrā 15 min, lai tiktu izgulsnēti produkti.
Piezīme. Izgulsnēšanas laiks īsāks par 15 min var būt nepietiekams īsu produktu izgulsnēšanai, bet laika periodā, kas garāks par 24 stundām var palielināties nesaistītu krāsu terminatoru izgulsnēšanās.
4. Stobriņus ievieto centrifūgā. Centrifugē 20 min pie maksimālā ātruma.
Svarīgi! Nākošo etapu izpildīt tūlīt pēc centrifugēšanas. Ja tas nav iespējams, tad tieši pirms turpināšanas, stobriņus centrifugē vēl 2 min.
5. Uzmanīgi ar pipeti nosūc supernatantu. Nogulsnes var būt redzamas vai arī nē.
Svarīgi! Supernatantu noņem pēc iespējas pilnīgāk, jo tas satur nesaistītus krāsu terminatorus. Jo vairāk supernatanta atstāj, jo vairāk nesaistītu terminatoru paliek paraugā.
6. Pievieno 200 - 250 ml 70% etanola un viegli savorteksē vai sakrata ar roku.
7. Stobriņus ievieto centrifūgā. Centrifugē 15 min pie maksimālā ātruma.
8. Supernatantu nosūc tāpat kā 5. etapā.
9. Paraugus žāvē termoblokā pie 70oC 5 -10 min.
1. 0,5 ml šūnu kultūras atšķaida ar 4,5 ml 0,15M NaCl.
2. Lej 2 3 ml stikla kivetē (biezums 0,5 cm).
3. Kiveti ievieto fotoelektrokolorimetra lodziņā Nr.2.
4. Kontroles kivetē ielej 2 3 ml 0,15M NaCl. Kontroles kiveti ievieto fotoelektrokolorimetra lodziņā Nr.1.
5. Ar kontroles kivetes palīdzību fotoelektrokolorimetru nokalibrē uz nulli.
6. Atšķaidītās kultūras blīvumu mēra pie 540 nm.
7. Iegūto rezultātu reizina ar 20 (šūnu kultūras atšķaidījums 10x, kivetes biezums 0,5 cm).
8. Galarezultāts, OD, aptuveni atbilst šūnu daudzumam, mg/ml. Lai iegūtu 1 mg šūnu, viens jādala ar iepriekš iegūto rezultātu. Iegūtais skaitlis ir šūnu kultūras daudzums ml, kurā ir 1mg šūnu.
9. Ņem attiecīgo ml daudzumu šūnu kultūras un iepilda 1,5 ml tilpuma plastmasas stobriņā.
10. Centrifugē 4 min pie 10000-13000 rpm.
11. Supernatantu nolej.
12. Paraugus glabā ledusskapī pie −20°C.
1. Plastmasas stobriņā sagatavo 20 mg šūnas, iesaldē pie -20 °C.
2. Sagatavo ledus vannu.
3. Pie šūnām pievieno 80 μl lizocīma līzes bufera, suspendē.
4. 3-4x (cik nepieciešams) iesaldē pie -70 līdz -80°C, 15 - 25 minūtes, un atkausē ledus vannā. Lizocīma un iesaldēšanas/atkausēšanas iedarbībā paraugam jākļūst viskozam.
5. Paraugam pievieno 2,5 μl Mg2+/DNāzes šķīduma. Vorteksē līdz paliek šķidrs. Ja paraugs nepaliek šķidrs, paraugu patur ledusskapī pie +4°C līdz 30 min.
6. Centrifugē 10 pie 6000 rpm.
7. Atdala supernatantu no debra.
8. Supernatants:
a) 10 μl + 90 μl Laemmli līzes bufera;
b) 10 μl imūndifūzijai;
c) atlikums tiek iesaldēts tālāko analīžu veikšanai (nepieciešamības gadījumā).
9. Debris (nešķīstošie šūnas proteīni):
a) Pievieno 500 μl 0,15M PBS, uzsuspendē;
b) No tā 100 μl centrifugē 3 - 4 pie 10000 rpm;
c) Supernatantu nolej, debrim pievieno 200 μl Laemmli līzes bufera.
10. Paraugus ar Laemmli līzes buferi suspendē uz Vortex, vāra ūdens vannā 7 min. Veic šķīstošā ekspresētā mērķproteīna noteikšanu ar PAGE-SDS un sekojošu imunoblotu.
1. Sagatavo ledus vannu
2. 1g šūnu uzsuspendē 3 ml A, pēc tam pievieno 1 ml C
3. Pārnes suspensiju stikla stobrā, ko tur ledusvannā.
4. 1 cikls: 15 sekundes USK,
45 sekundes miera periods un dzesēšana.
5. Var noņemt alikvotas pēc noteiktiem cikliem, lai noteiktu efektīvāko dezintegrēšanas ilgumu.
· Alikvotas pēc noteiktiem cikliem:
1. Noņem alikvotas 200 μl.
2. 20 μl liek uz imūndifūziju.
3. Pārējo centrifugē 1010000 rpm:
a) Supernatants 20 μl + 80 μl Laemmli līzes bufera;
b) Debrim pievieno 500 μl PBS, uzsuspendē. No tā paņem 100 μl, nocentrifugē, debrim pievieno 200 μl Laemmli līzes bufera.
4. Paraugus suspendē uz Vortex, vāra ūdens vannā 7 min. Veic šķīstošā ekspresētā mērķproteīna noteikšanu ar PAGE-SDS un sekojošu imunoblotu.
· Nedzidrināta parauga ekstraģēšana ar urīnvielu (UREA)
1. Nedzidrinātam paraugam (alikvota - A0: 10/90 10 μl paraugam pievieno 90 μl Laemmli līzes bufera) pievieno 1/16 tilpuma 8M UREA
2. Liek maisīties 30 aukstā istabā (A1: 10/90, ID-imūndifūzija), centrifugē uz T24 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (A1S: 20/80, ID)
b) Debrim (nešķīstošajiem šūnas proteīniem) pievieno 1 ml 1M UREA (A1D: 20/80)
3. Liek maisīties 30 aukstajā istabā, centrifugē uz mikrofūgas 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (A2S: 20/80, ID)
b) Debrim pievieno 1 ml 2M UREA (A2D: 20/80)
4. Liek maisīties 30 aukstajā istabā, centrifugē uz mikrofūgas 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (A3S: 20/80, ID)
b) Debrim pievieno 1 ml 8M UREA (A3D:20/80)
5. Liek maisīties 30 aukstajā istabā, centrifugē uz mikrofūgas 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (A4S: 20/80)
b) Debrim pievieno 200 μl Laemmli līzes bufera (A4D)
6. Noņemtajām alikvotām, 20 μl, pievieno 80 μl Laemmli līzes bufera. A0 un A1 ņem 10 μl un pievieno 90 μl Laemmli līzes bufera.
7. Paraugus suspendē uz Vortex, vāra ūdens vannā 7 min., veic šķīstošā ekspresētā mērķproteīna noteikšanu ar PAGE-SDS un sekojošu imunoblotu.
· Dzidrināta parauga apstrāde
1. Lizātus centrifugē 10 10000 rpm
Supernatanta izgulsnēšana ar amonija sulfātu (NH4)2SO4
1. Nomēra supernatanta tilpumu.
2. Puse no šī te tilpuma ir amonija sulfāta tilpums, kas jāpievieno šim te supernatantam.
3. Viegli vorteksējot lielo stobriņu, pakāpeniski (burtiski pa pilienam) pie supernatanta pievieno (NH4)2SO4.
4. Tad atstāj 10 min uz minirotatora griezties.
5. Tad to visu šķīdumu lej centrifugēšanas stobros un centrifugē 15 - 20 min pie 10 000.
6. Supernatantu nolej.
7. Stobriņu ar nogulsnēm glabā ledusskapī pie -20oC.
Nešķīstošo proteīnu (debra) ekstraģēšana ar urīnvielu (UREA)
1. Debrim (no 1 grama šūnu) pievieno 1 ml 0,5M UREA.
2. Liek maisīties 30 aukstajā istabā, centrifugē uz mikrofūgas 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (0,5-S: 20/80 20 μl paraugam pievieno 80μl Laemmli līzes bufera);
b) Debrim (nešķīstošā daļa) pievieno 1 ml 1M UREA.
3. Liek maisīties 30 aukstajā istabā, centrifugē uz mikrofūgas 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (1-S: 20/80);
b) Debrim pievieno 1 ml 2M UREA.
4. Liek maisīties 30 aukstajā istabā, centrifugē uz mikrofūgas 10 pie 10000 rpm:
a) Supernatants (2-S: 20/80);
b) Debrim pievieno 1 ml PBS, uzsuspendē, no tā ņem 100 μl, centrifugē 5 pie 10000rpm. Supernatantu nolej, debrim pievieno 100 μl Laemmli līzes bufera.
5. Paraugus suspendē uz Vortex, vāra ūdens vannā 7 min. Veic šķīstošā ekspresētā mērķproteīna noteikšanu ar PAGE-SDS un sekojošu imunoblotu.
1. Izkausē 0,8% agarozi (0.8 M-agarose in PBS), kas paredzēta imunoloģiskajai precipitācijai.
2. Izlej uz stikla vai plastmasas plāksnītes.
3. Kad agarozes šķīdums sacietējis, ar šablona palīdzību izveido bedrītes puķītes veidā (viena bedrīte vidū, sešas vienādos attālumos apkārt).
4. Paraugus un antivielas iepilda bedrītēs sekojošā veidā:
|
|
1 6 pilda ar kapsīdus saturošiem paraugiem pa 10 20 µl. AV pilda ar antivielām, 10 20 µl. Ja nepieciešams, kādā no bedrītēm var iepildīt kontroles antigēnu. |
5. Inkubē mitrā atmosfērā pie +4 līdz +6 °C vai istabas temperatūrā.
6. Precipitācijas zonas skatās pēc 24 - 48h.
1. Lai atbrīvotos no NaCl šķīduma, kas tika izmantots imūndifūzijā, gēlu 3 5 reizes skalo 30 min d.H2O laiviņā kratītājā.
2. Ievieto gēlu fiksācijas šķīdumā (Fixing solution) uz 5 10 min (vēlams, paralēli kratot);
3. Pārnes gēlu krāsvielu šķīdumā (Staining solution), šajā jaunajā šķīdumā inkubēt pie 5 20 min. kratot.
4. Gēlu 3 - 5 reizes skalo 30 min parastā ūdenī kratītājā - līdz rezultāti nemainās.
5. Pēc tam gēlu var gan nofotografēt, gan žāvēt.
|
Fixing solution |
Staining solution |
||
|
(uzglabāt pie NT cieši noslēgtā, tumšā traukā) |
|||
|
Perchloric acid |
4% |
Coomassie G-250 |
0,1 0,5% |
|
Ethanol |
50% |
Perchloric acid |
4% |
Guntars, lapa pēdējo reizi labota 22-01-2008 09:33