Šī pētījumā pamatā tika izmantotas 3 veidu DNS plazmīdas, kur divas no tām - I-902-13 (kopējais garums - 4693 bp) un I-901-35 (k. g. - 4693 bp) - tika izmantotas atsevišķu insertu iegūšanai, toties DNS plazmīda I-826 (k.g. - 4978 bp) vektora iegūšanai. Šīs plazmīdas satur promoteru Ptrp, kas ir nepieciešams ekspresijai prokariotos. Gala rezultātā bija jāpārbauda, vai jaunizveidotās plazmīdas spēj veidot kapsīdlīdzīgas struktūras.
Lai no DNS plazmīdas I-826 izdalītu vektoru, tai visupirms tika veikta preparatīvā restrikcija ar Xba I (virzās no paša sākuma līdz 30 as) un Kpn 2I (virzās no 144 as līdz pat beigām 183as) restrikcijas endonuleāžu palīdzību (pilna garuma HBcAg ir 183 as). Iegūtais maisījums tika sadalīts agarozes gēla un tad, izgriežot un attīrot to no gēla, pārbaudīts ar elektroforēzes palīdzību. Lai sekotu līdzi agarozes gēla elektroforēzei, izmantoju molekulmasas marķieri.
Lai no abām DNS plazmīdām I-902-13 un I-901-35 iegūtu nepieciešamos insertus, vispirms šo plazmīdu DNS, izmantojot attiecīgos praimerus, ar PCR palīdzību tika pavairoti uz programmējamā amlifikātora un pēc tam pārbaudīti elektroforēzē.
Turpmākajā apstrādes gaitā abi paraugi tika attīrīti ar hloroformu (CHCl3) un izgulsnēti ar etanolu. Pēc tam DNS I-902-13 tika sašķelts ar Xba I (30 as) un Cfr 9I (144 as), bet DNS I-901-35 ar Xba I un Kpn 2I endonukleāžu palīdzību. Tad, kā jau līdzīgi vektora gadījumā, tika veikta preparatīvā restrikcija, pēc kuras sekoja DNS attīrīšana no gēla, kuru pārbaudīju elektroforēzē. Rezultātā izveidojās divi atsevišķi inserti. Diemžēl elektroforēzes ainā redzams, ka inserts ir ļoti minimāli izdalījies. Tas varētu būt saistīts ar attīrīšanas procesu. Lai sasniegtu labākus gala rezultātus būtu lielāka uzmanība jāpievērš tieši attīrīšanas procesam.
Lai iegūtu rekombinantās plazmīdas, tālākais darba mērķis bija gan vektoru, gan insertu saliģēt kopā savā starpā. Reakciju veic T4 fāga DNS ligāze, kuru lieto ar lipīgiem galiem DNS molekulas sašūšanai. Kopā tika sašūti gan no DNS I-826 izdalītais vektors ar DNS insertu I-902-13, gan šis pats vektors kopā ar DNS insertu I-901-35. Lai vēlāk varētu atlasīt klonus, rekombinanto DNS saturošie maisījumi tika transformēti RR1 šūnās, kas tālāk tika izaudzētas mēģenēs. No DNS I-902-13 ieguva šūnas GZ-1, bet no DNS I-901-35 šūnas GZ-2.
Dotie GZ-1 un GZ-2 tika attīrīti no RNS ar RNāzes palīdzību. Lai varētu atlasīt pozitīvos klonus, veicu šķelšanu ar Xba I un Sal I. Salīdzinot šķelšanas produktu izmērus, var noteikt vai inserts ir ieklonējies un vai ir ieklonējies vajadzīgajā virzienā.
No šiem paraugiem uz sekvenēšanu izvēlējos pozitīvos (tos, kas atrodas apmēram 4236 bp augstumā). Gan pirms, gan pēc sekvenēšanas šos DNS paraugus attīrītu. Tas pats tiek izdarīts arī GZ-1 sintēzes gadījumā.
Ieguvu hromatogrammas, izmantojot ABI Prism Genetic Analyzer aparātu, un apstrādāju ar datorprogrammu Contig Express. Fragmentu sekvences ieguvu, salīdzinot abu ķēžu sekvenēšanas rezultātus. Iegūtās sekvences salīdzināju ar datorā uzkonstruētajām hipotētiskajām konstrukcijām. Iegūto konstrukciju sekvences sakrita ar hipotētisko konstrukciju sekvencēm, tātad klonēšana ir izdevusies veiksmīgi un iegūtās konstrukcijas var izmantot tālākiem mērķiem.
Lai pārbaudītu iegūto plazmīdu ekspresijas, ar tām konstrukcijām, kas izdevušās, veicu retransformāciju šūnās BL 21 un K 802.
5. att. Ekspresija M9+Cas barotnē BL21 un K802 šūnās.
Figure 5. Expression in M9+Cas culture medium in BL21 and K802 cells.
Pēc ekspresijas M9+Cas barotnē tika izvēlētas BL 21 šūnas tālākai eksperimentālajai gaitai. Izmantojot 20 mg šūnu, pagatavoju mīksto lizātu (ar lizocīmu un saldēšanas/atkausēšanas metodi). Pēc tam izvēlētie DNS paraugi tika uznesti uz imunoblota.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
6. att. Imunoblota rezultāti.
Figure 6. Results of immunoblot.
1. GZ-1-3 BL S1 (Supernatant1); 2. GZ-1-3 K 802 S1; 3. GZ-2-74 BL S1; 4 GZ-2-163 BL S1; 5. - GZ-1-3 BL D1 (Debris1); 6. GZ-1-3 K 802 D1; 7. GZ-2-74 BL D1; 8. GZ-2-163 BL D1;
Kā redzams 6. att., tad GZ-1-3 BL S1 mērķproteīni ir uzkrājušies supernatantā, kas varētu liecināt par sekmīgiem tālākiem elektromikroskopijas un imūndifūzijas rezultātiem, bet atlikušajā GZ-1 un GZ-2 paraugos proteīni diemžēl lielākoties ir uzkrājušies debrī.
Bet arī ar elektronmikroskopijas palīdzību nevienā no izvēlētajiem DNS paraugiem kapsīdus ar skaidrām kontūrām nekonstatēju.
Visbeidzot šie paši DNS paraugi tika pārbaudīti ar radiālās imunodifūzijas palīdzību. Arī tā diemžēl neko daudz nedeva, jo nebija izveidojušās precipitācijas zonas, ja neskaita kontroles antigēnu.
Tā kā rezultāti nav bijuši diezgan sekmīgi, tad gan GZ-1, gan GZ-2 tika ekstraģēti ar UREA un izgulsnēti ar NH4SO4 (amonija sulfātu).
7. att. Imunoblota rezultāti pēc ultraskaņas, ekstraģēšanas ar UREA un izgulsnēšanas ar (NH4)2SO4.
Figure 7. Results of immunoblot after ultrasound, extragetion with UREA and sedimentation with (NH4)2SO4.
Tālākā gaitā, ekstraģējot abus paraugus ar 1,5 M UREA, GZ-1 samazinās vairāk nekā GZ-2 gadījumā. Izgulsnējot ar amonija sulfātu, viss uzkrājās debrī.
Visbeidzot GZ-1 tika pārbaudīts ar elektronmikroskopijas palīdzību. Diemžēl arī tā neko daudz nedeva, jo gala rezultātā bija pamanāmas tikai kapsīdiem līdzīgas struktūras.
Guntars, lapa pēdējo reizi labota 22-01-2008 09:34