Escherichia coli šūnu transformācija ar kalcija hlorīdu
(CaCl2) metodi.
Saturs:
1. Ievads
3. Metode
5. Atsauces
1.Ievads
Bakteriju
transformācija ir viens no veidiem kā baktēriju šūna var
uzņemt svešu DNS un līdz ar to iegūt jaunas īpašības.
Proposed
Molecular Mechanism of DNA transformation of E. coli
Calcium
ions (++) complex with negatively charged oxygens(-) to shield DNA phosphates
from phospholipids at the adhesion zone.
Bloom V. Mark, Greg A. Freyer, David A. Mickols
2. Literatūras apskats
2.1. Vēsture
Dabisko
transformācijas procesu atklāja Freds Griffits 1928.gadā
pētot patogenitātes pārnesi no virulentiem Streptococcus
pneumoniae celmiem.O.T. Averis pierādīja, ka
transformējošais faktors ir dezoksiribonukleīnskābe. 20. gs.
60-tājos gados transormācijas izpētīšana
dzīvniekiem,70-tājosÞ augiem.
2.2.
Makslīga un dabiskā kompetence
Šūnas, kas spēj
uzņemt DNS tiek sauktas par kompetentām.
Pastāv divi jēdzieni: mākslīgā un dabiskā
kompetence.
Dabiskā transformācija ir sastopama atsevišķās
gram-pozitīvo (Streptococcus, Bacillus) un gram-negatīvo (Haemophilus,
Pseudomonas) baktēriju ģintīs. Dabisko kompetenci nodrošina
speciāli recipientās šūnas mehānismi, ar kuru
palīdzību svešā DNS tiek uzņemta šūnā. Tomēr ne visas
baktērijas šūnas ir spējīgas uzņemt svešu DNS (Eischerichia
coli).
2.3.
Transformācijas veidi
Šūnu apstrādāšana ar divu
valences katjoniem uz “aukstumā”;
Elektroporācijas (šūnas
sieniņas caursite ar strāvu) pamata;
Baktēriju sferoplastu un protoplastu
transformācija, pievienojot izolētu DNS polioglīkola
klātbūtnē.
Šūnu E.coli transformāciju
ar plazmīdu palīdzību var veikt ar tā saucamo kalcija
metodi.Tā ir pamatota uz konstatētu ar Mandeļa un Higa
faktu(1970), šūnas, kas tika turētas aukstumā,
kalcija-hlorīda
klātbūtnē, kļuva transformācijai kompetenti.
2.4. CaCl2
šķīdums
CaCl2
šķīdums īslaicīgi padara baktēriju šūnapvalkus
caurlaidīgus un atver plazmas membrānas poras,
tādējādi atļaujot DNS iekļūt šūnā.
Svarīgi, lai
transformējamās DNS koncentrācija būtu augsta un šūnu
kultūra, kurās tiks inducēta kompetence atrastos logaritmiskās
augšanas fāzes vidusdaļā(šūnas aktīvi augtu un
dalītos).
Tādā veidā
ir iespējams panākt praktiski jebkuras DNS iekļūšanu
šūnā.
3.Metode
3.1 CaCl2 protokols
1.Vienu koloniju no plates inokulē 5 ml 2*TY
barotnes un audzē pa nakti pie +37ºC
kratītājā;
2.
0.5 ml no iegūtas naktskultūras inokulē 50 ml 2*TY barotnes un
audzē divas stundas pie +37ºC kratītājā;
Anastasija Aniscenko
3.2. Pēc transformācijas izaudzētas šūnas
Celmu
nosaukums
Anastasija Aniscenko
3.3. – un + CaCl2
(+) Kalcija metode ir
lēta,atšķirībā no
elektroporācijas metodes;
(+)
Specefiski nav sarežģīta;
(+)
Metode nav būtiski atkarīga no transformējošas DNS;
(-)
Transformācijas efektivitāte sasniedz 107 transformantu uz 1µg
DNS(elektroporācijas metodē sasniedz 3*109 transformantu uz 1 µg
DNS).
3.4. Transformācijas efektivitāte
Transformācijas
efektivitāte ir atkarīga no bakteriālā celma, un no
transformējošāš DNS struktūras. Divpavedienu un vienpavedienu
gredzenveida molekulas, kā arī lineāras molekulas ar gala
tapiņām, kas kovalenti nosedz abus DNS pavedienus, labi
transformē šūnas, laikā, kad DNS lineāras molekulas ar
atvērtiem galiem, veic transformāciju divas-trīs reizes
sliktāk, jo hidrolīzējas ar eksonukleāzam E.coli
šūnās.
4. Transformācijas
aktualitāte
4.1. Transformācijas pielietojums un
transformētājam šūnam jaunas īpašības
Gēnu
inženierijā plaši pielieto baktēriju šūnu transformāciju ar
plazmīdu DNS. Izmantojot plazmīdu vektorus kā nesējus,ar
transformācijas palīdzību ir iespējams šūnā
ievadīt un pavairot DNS no jebkura organisma. Dabiskās baktēriju
plazmīdas var piešķirt transformētajām šūnām
jaunas īpašības (spēju konjūgēt,rezistenci pret
noteiktām antibiotikām,spēju producēt
bakteroicīnus,spēju metabolizēt dažādus ķīmiskos
savienojumus.
5. Atsauces
http://plaza.ufl.edu/johnaris/Protocols/RNADNA/CompetentCellCaCl.pdf
Šajā lapā jūs iepazīsieties ar
Escherichia coli šūnu transformāciju ar kalcija hlorīda
palīdzības metodi. Ir aprakstīti metodē izmantotie
komponenti,to vajadzīgais daudzums un vajadzīgā
temperatūra, kā arī laiks. Angļu valodā.
http://www.biotechnolog.ru/ge/ge10_1.htm
No šīs lapas jūs uzzināsiet
kopējo informāciju par bakterijas šūnas Escherichia coli
ģenētisko transformāciju. Par E.coli īpatnējo
veidošanu. Par īpatnējiem apstākļiem,kuri ir
nepieciešami,lai pārvarētu šūnas sieniņas barjeru un to
apstākļu veidošanos.
Krievu valodā
http://online-media.uni-marburg.de/biologie/genetik/boelker/Current_Methods/Vectors_1+2s.pdf
No šīs lapas jūs uzzināsiet par
transformācijas sistēmu (transformējošais DNS-vektors). Iemeslu un nozīmību
DNS-vektoru ievietošanai šūnā(kodols).Par
atšķaidījumiem uz Petri traukiem.Par E.coli augšanu uz barotnes ar
antibiotiku,kā arī par E.coli rezistenci pret to. Viss ir
apskatāms ar shēmām, zīmējumiem,
fotogrāfijām un tabulām. Angļu valodā.
http://userpages.umbc.edu/~jwolf/m7.htm
Šajā lapā jūs iepazīsieties ar
šauru aprakstu par Escherichia coli šūnas transformāciju ar
elektroporācijas metodi. Ir salīdzināta elektroporācija ar
ķīmiskajām metodēm. Ir aprakstīti vajadzīgie
materiāli, aparāti, vielas(to šķīdumi). Angļu
valodā.
http://www.nd.edu/~chem191/b2.html
Šajā lapā jūs iepazīsieties ar
īsu aprakstu par izolētu DNS, DNS restrikciju (ir parādīts
shematiski), DNS legēšānu, transformāciju (arī ir
shematiski),elektroforēzi. Šajā lapā apskatītas vēl
vairākas citas metodes, atklašānas un novērojami. Angļu
valodā.
Izmantota literatūra
1.
Balbas P., Lorence A. 2004. Recombinant gene
Expression; Rewiews and Protokols, Second Edition. From Methods in Molecular
Biology, vol 267; all 491.
2.
Bloom V. Mark, Greg A. Freyer, David A. Mickols
1996. Laboratory DNA Science. An Introduction to Recombinant DNA. Tehniques and
Methods of Genom Analysis, vol. 73-140; all 434.
3.
Rostoks Nils (sastādītājs). 1998.
Baktēriju ģenētika. Laboratorijas darbu apraksts Lielā
praktikuma nodarbībām, vol. 8-14; all 67.
4.
Рыбчин
В.Н. 1999. Основы
генетической
инженерии,
ст. 65-100; 188-205. Всего 521.
Autors: Anastasija Aniscenko
Lapa veidota: 11/28/2008
Lapa atjaunota: 11/28/2008