Strādājot ar šūnu kultūrām, tai skaitā ar Caco-2, izmanto dažādas metodes:

  1. Analītiskās metodes (fluorescences mērīšana, šūnu proliferācijas un dzīvotspējas metodes, TEER, HPLC)

  2. Funkcionālie pētījumi (caurlaidības eksperimenti, enzīma aktivitātes mērījumi, statiskā analīze) (Siisalo 2009).

Analītiskās metodes

Šūnu proliferācijas un dzīvotspējas noteikšanas metodes

Lielākoties metodes, kuras izmanto šūnu dzīvotspējas noteikšanai ir balstītas uz vienu no šādiem parametriem : metaboliskā aktivitāte vai arī šūnas membrānas integritāti.


Attēls :Anonymous 6

Parasti metabolisko aktivitāti mēra šūnu populācijās, kuras ir inkubētas kopā ar tetrazola sāļiem (MTT, XTT, WST-1), kuri metaboliski aktīvās šūnās pārvēršas krāsainā formazāna reakcijas gala produktā.
Otrā tipa metodēs, kuras ir balstītas uz šūnas membrānas integritāti, tiek dēvētas par krāsvielu izslēdzošām metodēm. Par krāsvielu, piemēram, tiek izmantota tripāna zilā krāsviela. Nedzīvās šūnas iekrāsosies un itin viegli varēs saskaitīt dzīvās šūnas.
Šūnu dzīvotspēju var izmērīt ne tikai izmantojot  kolometriskās metodes. bet arī - radioaktīvās iezīmes, piemēram, 51Cr (Anonymous 3 ).

TEER (Transepitēlija elektriskās rezistences mērījumi)

Viena no svarīgākajām epitēlija šūnu īpašībām in vivo ir necaurlaidīgu barjeru veidošana, kuras veido intracellulārie savienojumi, kuri ir zināmi kā ciešie savienojumi. Polarizētam epitēlija vienslānim arī piemīt spēja veidot šādas barjeras.
Viens no elektrodiem tiek ievietots apikālajā barotnes daļā, bet otru ievieto bazolateriālajā barotnes daļā. Elektriskās rezistences vērtība tiek izteikta kā laukuma rezistence (Ω*cm2) un tā tiek aprēķināta sareizinot aparāta uzrādīto vērtību (omos) ar filtra laukumu. Parasti Caco-2 polarizētajiem vienslāņiem vērtība ir apmēram 200 - 250 ( Ω*cm2) (Clark L. V. & Bavoil M. P. 1994)

HPLC (Augstas izšķiršanas šķidruma hromatogrāfija)

Šī metode ir viena no kolonnu hromatogrāfijas veidiem. Šo metodi izmanto, lai  atdalītu, identificētu un kvantificētu maisījumus, pamatojoties uz savienojumu atšķirīgo polaritāti un mijiedarbību ar kolonnas stacionāro fāzi. HPLC var izmantot vairāku veidu stacionārās fāzes (parasti - hidrofoba, ar oglekļa saitēm), ir arī pumpis, kurš pārvieto mobilo fāzi un analizē maisījumu kolonnā, kā arī ir detektors, kurš nosaka analizējamā maisījuma laiku kolonnā (Anonymous 2).


Attēls :Anonymous 4


Funkcionālie pētījumi

Membrānas caurlaidības noteikšana

Tiek aprēķināts caurlaidības koeficents (P app, cm/s)

P app = dQ/dt*1/60*1/A*1/C0, kur
dQ/dt ir caurlaidības ātrums (µg vienā minūtē)
A ir membrānas virmas laukums (cm2)
C0 ir sākuma zāļu koncentrācija donora kambarī (µg mL) ( Evans R. C. & Packer L. 2003).

Plūsmas ātrums caur membrānu tiek aprēķināts izmantojot caurlaidības koeficentu:

Plūsmas ātrums = P app, B→A/ P app, A→B
A - apikālā membrānas puse

B - bazolateriālā membrānas puse (Siissalo 2009).

Enzīma aktivitātes mērījumi

Enzīmi ir proteīni, kuri  darbojas kā katalizatori organisma ķīmiskajās reakcijās.
Viena no izplatītākajām proteīna daudzuma noteikšanas metodēm ir BCA (bicinchoninic acid) proteīna reaģenta metode. Tā ir kolometriska metode, kur rezultātu ieguvei izmanto viļņa garumu 562nm. Reakcija, kura nodrošina BCA krāsas izveidošanos ir cieši saistīta ar 3 aminoskābju atlikumiem (cisteīns, tirozīns un triptofāns) proteīna aminoskāju sekvencē (Anonymous 5)

Statistiskā analīze

Tika izmantots Stjūdenta t-tests, ar statistisko ticamību p < 0,01.
Skrīninga metodes statistisko kvalitāti var noteikt aprēķinot Z faktoru.
Z faktors = 1- 3*(
Ϭ p + Ϭ n) /, kur
µ = vērtība, Ϭ = standartnovirze, p = pozitīvā kontrole, n = negatīvā kontrole (Siissalo 2009).

Uz sākumlapu