Dažādus šūnu fiksēšanas aģentus var iedalīt pēc to ķīmiskajām un/vai fizikālajām raksturīgajām īpašībām un šo aģentu iedarbības uz fiksējamo paraugu. Aģenti (vielas), kas veido kovalentās saites, ir aldehīdi - formaldehīds, paraformaldehīds (kas ir formaldehīda polimērs), glutaraldehīds (Rogers 1999), glioksāli, hidroksiadipaldehīds, krotonaldehīds, piruvikaldehīds, metahroleīns. Vēsturiski kā pirmie aldehīdus saturošie fiksēšanas aģenti tika pētīti glioksāls un glutaraldehīds, kas tiek izmantots arī mūsdienās, kā arī hidroksiadipaldehīds (Sabatini et al. 1963). Kā izgulsnējošie fiksēšanas aģenti jāmin alkoholus saturošas vielas, piemēram, etanols, metanols un citi (McSharry 1994, Kumarasinghe et al. 1997, Gillspie et al. 2002, Perlmutter et al. 2004)
Tā kā laboratoriju praksē visbiežāk tiek izmantots formaldehīds, paraformaldehīds, etanols un metanols, tad galveno uzmanību pievērsīšu šiem ķīmiskajiem fiksēšanas aģentiem.
Formaldehīds, ko rūpnieciskajā ražošanā var iegūt no metanola, jau izsenis ticis izmantots kā dezinfekcijas līdzeklis, kas nogalina lielāko daļu baktēriju un sēņu.
Formaldehīds veido saites aktīvajos centros gan vienā un tajā pašā olbaltumvielā, gan starp dažādām olbaltumvielām ar metilēna tiltiņu palīdzību (Ramos-Vara, Beisseherz 2000), tādā veidā nodrošinot to nemainību. Tā kā šim fiksēšanas reaģentam ir mazas molekulas, tas samērā viegli iekļūst caur šūnu ekstracellulāro membrānu, taču saistīšanās ar olbaltumvielām notiek lēnu, tādēļ fiksēšanai jānotiek vismaz 24 stundas (Lillie & Fullmer 1976 cit. pēc Kiernan 2005). Tiek pieņemts, ka fiksēšanas sākumposmā formaldehīds aptur šūnu autolīzi un pēc tam stabilizē olbaltumvielu struktūru (Kiernan 2005).
Formaldehīdu izmanto arī kā konservējošu šķīdumu dažādu audu saglabāšanai (Miething et al. 2006), taču daži pētnieki uzskata, ka tas diezgan nopietni traucē biomolekulu (mRNS un olbaltumvielu) analīzi (Perlmutter et al. 2004). No formaldehīdā fiksētiem un parafīnā ieslēgtiem preparātiem iespējams izdalīt mRNS, bet fiksēšana formalīnā, kas bijusi ilgāka par 48 stundām, negatīvi ietekmē kvantitatīvo reālā laika PCR (RT-qPCR), kuru izmanto gēnu ekspresijas noteikšanai (Macabeo-Ong et al. 2002). Pētījumos parādīts, ka šūnās, kas fiksētas ar formalīnu, veidojas gan strukturālas, gan ķīmiskas izmaiņas šūnas DNS (Nassiri et al. 2008).
Otru pieminēto aldehīdu grupas fiksēšanas aģentu paraformaldehīdu nereti izmanto, lai imunoloģiski iezīmētu neirālo šūnu marķierus (Sakumoto et al. 2009). Paraformaldehīds stabilizē caurlaidīgās šūnu membrānas, aizkavējot iekššūnu proteīnu saistīšanos ar ārpusšūnas molekulām (Imbert-Marcille et al. 2000). Fiksēšanā svarīga ir arī fiksēšanas aģenta koncentrācija, piemēram, 3% paraformaldehīds fiksētās šūnās nodrošina lielāku struktūru stabilitāti un viengabalainību, nekā 1% paraformaldehīds (Murrell-Bussell et al. 1998). Paraformaldehīds vairākos eksperimentos ir atzīts kā labāks šūnas morfoloģijas saglabātājs, salīdzinājumā ar alkoholus saturošajiem fiksēšanas aģentiem (Bhadriraju et al. 2007).
Šūnu
fiksēšanai var
izmantot arī aģentu maisījumus dažādās attiecībās, piemēram,
glutaraldehīds/formaldehīds 0,1% / 2% (Zini,
Branca 2003). Kombinējot
savā
starpā aldehīdu un alkoholu saturošos aģentus, piemēram,
paraformaldehīdu un
metanolu, var iegūt labākus rezultātus, lai detektētu šūnas citoskeleta
elementus, piemēram, tubulīnu imunofluorescentai iezīmēšanai (Pollice et al. 1991).
Alkoholu grupas fiksēšanas aģents metanols var tikt izmantots šūnu dehidrēšanā (atūdeņošanā), kā arī fiksācijā, taču jāatceras tam piemītošās atūdeņojošās īpašības, kas var radīt šūnu saraušanos un artefaktus.
Metanols,
tāpat kā
etanols, tiek atzīts par piemērotu fiksēšanas aģentu citoloģiskām
uztriepēm,
kur tas labi saglabā citoplazmas un kodola struktūrelementus (Kumarasinghe et al. 1997).
Fiksēšanai izmantojot metanolu kopā
ar etiķskābi, var pētīt šūnas DNS struktūru, taču to nav ieteicams
izmantot,
sīkāk pētot hromatīna struktūru (Kozubek
et al. 2000). Tā kā
metanols labi
saglabā vīrusu antigēnus (McSharry 1994),
kā arī palielina intracelulāro
antigēnu fluorescenci, to bieži izmanto virusoloģijā, sagatavojot
materiālu
plūsmas citometrijai (Schimenti
& Jaccobberger
1992
cit. pēc Imbert-Marcille et al. 2000).
Etanols tiek uzskatīts par piemērotu fiksēšanas aģentu histoloģiskiem preparātiem, kurus pēc fiksēšanas ir viegli uzglabāt un izmantot tālākai biomolekulu analīzei (Perlmutter et al. 2004).
Tā kā aldehīdus saturošie fiksēšanas aģenti veido šķērssaites starp proteīnu molekulām, kuras ir grūti saraujamas, šī fiksēšanas aģentu grupa nav piemērota biomolekulu analīzei, piemēram, divdimensionālajai poliakrilamīda gēla elektroforēzei (2D-PAGE). Padziļinātām klīniskajām un molekulārajām analīzēm tiek ieteikts izmantot 70 % etanolu (Gillespie et al. 2002), kas ir izgulsnējošs fiksēšanas reaģents.
Lapu veidoja: Vika Vorobjeva
Lapa veidota: 17.01.2010.
Pēdējās izmaiņas:2010.01.20 10:56